[發明專利]一種植物植原體基因組的測序方法

有效

• 申請號: 201811354428.0
• 申請日: 2018-11-14
• 公開（公告）號: CN109207617B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 范國強;翟曉巧;趙振利;曹喜兵
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發明公開了一種植物植原體基因組的測序方法，其中，包含獲取富含植原體的白花泡桐組織培養幼苗莖；白花泡桐和植原體基因組的DNA混合物分離提取；白花泡桐和植原體基因組的DNA混合物測序；植原體基因組測序數據的處理、統計和組裝和對白花泡桐和植原體的轉錄組進行測序，驗證基因組的可靠性。本發明首次得到了泡桐叢枝植原體的基因組，并通過該基因組對泡桐叢枝病原菌與寄主相互作用的信息進行了分析，該發明有助于增加了解植原體基本代謝途徑信息，為全面揭示植物植原體基因組信息奠定基礎。

技術領域

本發明涉及基因測序技術領域，特別是涉及一種植物植原體基因組的測序方法。

背景技術

植原體是一種特殊的多形性無細胞壁的細菌，寄生在植物的韌皮部篩管中，可以通過昆蟲進行傳播，引起世界范圍內數百種植物發生病害，其中包括一些重要的經濟作物，如小麥，玉米，花生等，造成巨大的經濟損失。此外，許多由植原體引起的新疾病正在出現，因此，開展植原體基因組的研究是有必要的對于分析植原體的遺傳進化和致病機理有重要意義。到目前為止，世界范圍內在近400余種植原體中僅報道了用脈沖電泳等方法繪制的6種植原體完整的基因組序列：‘Ca.P.asteris’洋蔥黃化植原體(OY-M)，翠菊黃化叢枝植原體(AY-WB)，玉米簇生植原體M3，‘Ca.P.mali’蘋果簇生植原體(AT)，‘Ca.P.australiense’澳大利亞葡萄黃花植原體(PAa)和草莓致死黃花植原體(SLY)。此外，還繪制了16SrIII組中的X疾病植原體、花生叢枝植原體、‘Ca.P.pruni’植原體(CX)和16SrIII-J組的紫松果菊叢枝植原體的基因組草圖的繪制工作。

已有的基因組研究分析表明，植原體的基因組普遍較小，其范圍為530至1,350kb，其DNA的G+C含量非常低，在23.0-29.5％范圍內。此外，這些植原體之間存在相當大的差異，在已發表的完整基因組中最小的是AT，其基因組大小僅為602kb，且其染色體是線性組成的，而其他已發表的基因組是圓形的，AT和其它植原體之間存在顯著差異。與植原體相關的質粒首先在玉米叢生植原體中報道。直到最近，已經報道了23種來自各種植原體菌株的質粒并進行了測序。來自不同植原體的這些質粒，不僅在數量上有很大差異，而且在大小上也有很大差異。而現有技術中還未對泡桐叢枝植原體以及它的遺傳需求、基因組特征和進化關系有足夠的了解。由于植原體不能在無細胞的人工培養基上培養，所以難以制備和純化足夠量的植原體DNA用于基因組測序，因此，植原體基因組學測序受到限制，因此植原體基因組的獲取手段很大程度上取決于與其宿主DNA的分離技術。

因此，提供一種植物植原體基因組的測序方法，對泡桐叢枝植原體進行測序，并對該病原菌與泡桐叢枝相互作用的信息進行了分析是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明首次得到了泡桐叢枝植原體的基因組，并通過泡桐叢枝植原體的基因組對該病原菌與泡桐相互作用的信息進行了分析，不僅有助于增加了解植原體基本代謝途徑的信息，而且為更全面披露植物植原體大基因組奠定基礎。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種植物植原體基因組的測序方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)獲取富含植原體的白花泡桐組織培養幼苗莖

在培養基上培養含有植原體的泡桐叢枝幼苗，每天25-29℃、130μmol·m^-2s^-1光照，14-18小時周期條件下培養28-32天，后收獲幼苗的嫩莖段,在液氮中冷凍后，儲存在-80℃冰箱；

(2)白花泡桐和植原體基因組的DNA混合物分離提取；

采用CTAB法提取白花泡桐和植原體的混合基因組DNA，并在OD₂₆₀/₂₈₀和OD₂₆₀/₂₃₀的吸光度值下評估DNA樣品的純度，并檢測DNA的完整性，最后純化DNA樣品，并將DNA保存在-80℃以備后用；