[發明專利]一種植物植原體基因組的測序方法

有效

• 申請號: 201811354428.0
• 申請日: 2018-11-14
• 公開（公告）號: CN109207617B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 范國強;翟曉巧;趙振利;曹喜兵
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

1.一種植物植原體基因組的測序方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)獲取富含植原體的白花泡桐組織培養幼苗莖

在培養基上培養含有植原體的泡桐叢枝幼苗，每天25-29℃、130μmol·m^-2s^-1光照，14-18小時周期條件下培養28-32天，后收獲幼苗的嫩莖段， 在液氮中冷凍后，儲存在-80℃冰箱；

(2)白花泡桐和植原體基因組的DNA混合物分離提取；

采用CTAB法提取白花泡桐和植原體的混合基因組DNA，并在OD260/280和OD260/230的吸光度值下評估DNA樣品的純度，并檢測DNA的完整性，最后純化DNA樣品，并將DNA保存在-80℃以備后用；

(3)白花泡桐和植原體基因組的DNA混合物測序；

用g-TUBE中斷富含所述植原體的白花泡桐基因組DNA，并富集和純化DNA片段，然后對片段化的DNA進行損傷修復和末端修復；

采用連接酶將DNA片段兩端與接頭連接；未能連接的DNA片段用外切酶切除，然后對連接產物進行純化，同時對文庫進行評估，最后將DNA模板和酶的混合物，進行實時單分子測序；

(4)植原體基因組測序數據的處理、統計和組裝；

在測序數據中去除接頭和低質量讀長得到高質量讀長，同時去除與寄主泡桐相似的讀長；

然后將高質量讀長進行組裝，先將長讀長用作種子糾正短讀長，其中大于8366bp的讀長作為長讀長，小于8366bp的讀長作為短讀長，再對用作種子的高質量讀長進行組裝；最后，將原始數據與組裝的參考序列進行比對，并對組裝后的結果進行優化和校正；

進行測序深度分析，去掉覆蓋深度低于100.00X的低深度重疊群，連接其余的重疊群；組裝后， 將原始數據與組裝的參考序列比對，計算參考序列的覆蓋深度和百分比；

(5)對白花泡桐和植原體的轉錄組進行測序，驗證基因組的可靠性；

步驟（4）中，所述低質量讀長為：除接頭外，未知堿基比例大于10％的讀長和質量值小于10的堿基數占整條讀長的50％以上讀長。

2.根據權利要求1所述的一種植物植原體基因組的測序方法，其特征在于，步驟(2)中，CTAB法提取泡桐叢枝和植原體的混合基因組DNA的方法為：將樣品研磨成粉末，吸取65℃預熱的CTAB 1000μL加入含有0.1-0.2g研磨好的樣品的離心管中，充分混合，再加入等體積的溶液混合物一充分混合后離心；吸出液體上清液再加入等體積的溶液混合物二，充分混勻后離心；再吸出液體上清液，加入1/10體積3mol/L的NaAc，pH5.2和2.5倍體積的無水乙醇輕輕攪拌均勻；離心后棄去液體上清液；加入70％乙醇，沖洗DNA沉淀物，然后離心棄去上清液；最后將DNA干燥后加入無菌雙蒸水再加入RNAase，37℃，保持30分鐘；

所述溶液混合物一為：體積比分別為25：24：1的苯酚、氯仿和異戊醇混合物；

所述溶液混合物二為：體積比分別為24：1的氯仿與異戊醇混合液。

3.根據權利要求1所述的一種植物植原體基因組的測序方法，其特征在于，步驟(4)中，對所述高質量種子讀長組裝的方法為：對所述高質量種子讀長，采用OLC assemblyalgorithm軟件進行組裝。