[發明專利]一種細胞和組織凍存保護劑及其凍存方法

在審

• 申請號: 201811353614.2
• 申請日: 2018-11-14
• 公開（公告）號: CN109287618A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 張鍵;趙華山;楊雅莉
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

本發明涉及一種組織凍存保護劑，屬于細胞生物學領域。具體公開了一種組織凍存保護劑，所述組織凍存保護劑包括支架材料，所述支架材料包括海藻酸鈉溶液和鈣離子溶液；所述海藻酸鈉溶液和鈣離子溶液分別獨立設置。所述的組織凍存保護劑能夠輔助保護原代神經組織抵御冷凍刺激，最大限度的保證神經元凍存活性。

技術領域

本發明屬于細胞生物學領域，具體涉及一種神經元凍存保護劑。

背景技術

在圍繞神經系統的研究中，神經元的原代分離培養是非常重要的體外工具，用于研究神經細胞的各種生理功能，由于神經組織獲得的局限性，關于神經元原代分離主要是在嚙齒動物上進行，無法完全模擬人類神經元的諸多特性，而且，由于人類神經組織不易獲得，且神經元細胞屬于終末分化的細胞類型，沒有增殖能力，因此，能凍存使用不易獲得的人神經細胞組織，可極大的發揮有限組織細胞的使用率。

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。細胞凍存時向培養基中加入保護劑--終濃度5％-15％的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點降低，在緩慢凍結條件下，細胞內水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。采用慢凍快融的方法能較好地保證細胞存活。標準冷凍速度開始為-1到-2℃/min，當溫度低于-25℃時可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(-196℃)。

目前細胞的凍存已經較為普遍，對于腫瘤細胞系的保存方法通常采用凍存方法保存，但是對于正常細胞的保存，尤其是神經細胞的保存通常存在不易凍存，且復蘇后無法進行原代細胞培養或者培養效率低等缺點。

而對于組織樣品的保存，相比于細胞的保存更加不易，由于組織在冷凍過程中容易形成冰晶破壞細胞活性，采用組織凍存后通常進行分子生物學方面的形態表達分析，而無法做到原代細胞的培養。中國專利CN107494516A公布了一種小鼠腦片凍存液，該凍存液中包含蔗糖，緩沖鹽以及乙二醇，通過凍存處理后得到的腦組織通過免疫組化實驗證明腦片的形態和結構完好，屬于一種組織化學保存液，即無法分離神經細胞進行原代培養活細胞。

在現有技術中，針對非腫瘤類組織細胞的凍存保護方法研究還很有限，實現凍存后的組織依然保持原代細胞培養活性的難度也還很大。

發明內容

基于現有技術中存在的問題，本發明提供一種基于海藻酸鈉鈣交聯支架材料的凍存保護劑，可明顯提高原代神經元組織的凍存效果。

本發明一個方面提供了一種組織凍存保護劑，所述組織凍存保護劑包括支架材料，所述支架材料包括海藻酸鈉溶液和鈣離子溶液；所述海藻酸鈉溶液和鈣離子溶液分別獨立設置。

在本發明的技術方案中，海藻酸鈉溶液中海藻酸鈉質量濃度為0.01-10％，優選為0.1-3％，更優選為0.5％。

在本發明的技術方案中，鈣離子溶液中含鈣離子濃度為10-100mM，并配置為等滲溶液，優選的，鈣離子溶液中鈣離子濃度為50mM氯化鈣溶液。

在本發明的技術方案中，所述組織選自人體或動物體的任意組織，優選為腦組織、肌肉組織、腫瘤組織、卵巢，子宮內膜、胚胎，所述的腦組織更優選為腦皮質或海馬組織或胚胎期腦組織；所述的細胞選自人體或動物體的任意細胞，優選為腦組織、肌肉組織、腫瘤組織、卵巢，子宮內膜、胚胎，所述的腦組織更優選為腦皮質或海馬組織或胚胎期腦組織來源的細胞。。

本發明另一個方面提供了上述組織或細胞凍存保護劑在組織凍存預處理中的用途。

本發明另一個方面提供了上述組織或細胞凍存保護劑作為組織凍存預處理液的用途。