[發(fā)明專利]一種同時(shí)產(chǎn)五種稻曲病菌毒素的稻曲病菌的鑒定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811351429.X
• 申請(qǐng)日: 2018-11-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109355417A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林曉燕;牟仁祥;曹趙云;曹珍珍;馬有寧;陳銘學(xué)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水稻研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6806;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 昆明合眾智信知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 53113
• 代理人: 錢磊

1.一種同時(shí)產(chǎn)稻曲病菌毒素A、B、C、D和F的稻曲病菌的鑒定方法，其特征在于，所述鑒定方法包括：

分子鑒定：將純化并處于保藏狀態(tài)的菌株拿到室溫狀態(tài)進(jìn)行菌種解凍，將解凍后的菌種接種到新鮮配制的無(wú)菌PSA平板上進(jìn)行活化，從PSA分離平板上挑取活化后的菌株接種于PS液體培養(yǎng)基中，于150r/min、28℃條件中培養(yǎng)7天后，用離心管收集菌絲，采用真菌基因組提取試劑盒提取菌絲總DNA，nanodrop 2000C超微量分光光度計(jì)DNA純度后，利用真菌18S引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再利用PCR回收試劑盒回收純化得到目的片段，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，返回得到測(cè)序結(jié)果，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上利用Blast軟件進(jìn)行核酸序列比對(duì)分析，根據(jù)篩選到的菌株序列與稻曲病菌屬菌株序列的同源性判斷篩選到的菌株是否為稻曲病菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)產(chǎn)稻曲病菌毒素A、B、C、D和F的稻曲病菌的鑒定方法，其特征在于，所述鑒定方法還包括：

菌落形態(tài)觀察：將純化并處于保藏狀態(tài)的菌株拿到室溫狀態(tài)進(jìn)行菌種解凍，將解凍后的菌種接種到新鮮配制的無(wú)菌PSA平板上進(jìn)行活化，待菌種復(fù)壯成菌絲塊后，用尖頭挑針挑取活化平板上的小菌絲塊，接種于新鮮配制的無(wú)菌PSA平板上，28℃黑暗條件下培養(yǎng)7-14天，觀察無(wú)菌PSA平板上的菌落形態(tài)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)產(chǎn)稻曲病菌毒素A、B、C、D和F的稻曲病菌的鑒定方法，其特征在于，所述鑒定方法還包括：

孢子形態(tài)鑒定：將純化并處于保藏狀態(tài)的菌株拿到室溫狀態(tài)進(jìn)行菌種解凍，將解凍后的菌種接種到新鮮配制的無(wú)菌PSA平板上進(jìn)行活化，活化后的菌株接種于50mL PS的250mL三角瓶中，置于150r/min、28℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7-10天，得到菌絲孢子混合液，將此混合液經(jīng)四層紗布過(guò)濾后所得濾液，即為薄壁分生孢子液，在400倍顯微鏡下觀察稻曲病菌的孢子形態(tài)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)產(chǎn)稻曲病菌毒素A、B、C、D和F的稻曲病菌的鑒定方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的體系為：10×Taq緩沖液5μl、10pmol的ITS1引物和ITS4引物各1μl、真菌總DNA提取液2μl、1U Taq DNA聚合酶1μl、2.5mM MgCl₂2μl、2mmol/L dNTPs 3μl，無(wú)菌水補(bǔ)足至50μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種同時(shí)產(chǎn)稻曲病菌毒素A、B、C、D和F的稻曲病菌的鑒定方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的條件為：95℃變性3min，95℃1min，59℃1min，72℃延伸1min，循環(huán)35次，72℃延伸10min。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)稻曲病菌毒素A、B、C、D和F的稻曲病菌的鑒定方法，其特征在于：所述的培養(yǎng)基為：馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)：去皮馬鈴薯200g，加水1000mL煮沸20～30min，加熱過(guò)程中注意補(bǔ)充水分，用八層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入20g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，再加入20g蔗糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000mL，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，121℃高壓濕熱滅菌20分鐘后取出試管擺斜面或者搖勻，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)稻曲病菌毒素A、B、C、D和F的稻曲病菌的鑒定方法，其特征在于：所述的培養(yǎng)基為：馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PS)：去皮馬鈴薯200g加水1000mL煮沸20～30min，加熱過(guò)程中注意補(bǔ)充水分，用八層紗布過(guò)濾，濾液加蔗糖20g攪拌至完全溶解，定容至1000mL，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，121℃高壓濕熱滅菌20min后取出冷卻備用。