[發明專利]一種煙草氯離子吸收基因NtSLAC2及其克隆方法與應用

有效

• 申請號: 201811348443.4
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109439668B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 白戈;謝賀;逄濤;楊大海;李勇;姚恒;童治軍;張誼寒;肖炳光;李永平
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業) 53116
• 代理人: 姜開俠;謝喬良

本發明公開了一種煙草氯離子吸收基因NtSLAC2及其克隆方法與應用，煙草氯離子吸收基因NtSLAC2核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本發明還公開了煙草氯離子吸收基因NtSLAC2的克隆方法，具體步驟包括：提取煙草RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA；以反轉錄得到的第一鏈cDNA作為模板，根據NtSLAC2基因序列設計合成特異性引物，進行PCR擴增，回收和純化PCR擴增產物，并測序。本發明中，在煙草植株內抑制煙草內源基因NtSLAC2的表達，會使煙草煙葉的氯離子含量明顯降低，在植物低氯離子含量育種領域具有廣闊的應用前景，其經濟效益潛力巨大。

技術領域

本發明屬于遺傳工程技術領域，具體涉及一種煙草氯離子吸收基因NtSLAC2的克隆方法與應用。

背景技術

氯離子含量是煙草中重要的質量參數，煙葉中的氯離子含量以0.3~0.8作為合適，如果煙葉中氯離子含量過高，會影響卷煙制品的燃燒性，會造成卷煙制品的陰燃，從而會使卷煙制品的煙氣中具有更多的一氧化碳及焦油，這樣會危害消費者的健康。并且當氯離子含量更高的時候，會直接造成熄火的現象。

目前我國在種植蔬菜和糧食作物的時候，會使用大量的化肥農藥，現在的化肥中含量大量的氯離子，而這些含有氯離子的化肥在使用的過程中會造成耕作土壤中氯離子含量的超標。而土壤氯離子含量的超標會造成栽培作物過量的吸收氯離子從而造成作物體內的氯離子含量超標，這樣會影響農作物的品質。

為解決煙葉氯離子含量偏高的問題，采用低氯含量化肥是最直接的手段，但是考慮到低氯含量化肥的生產成本要顯著的高于高氯含量化肥，因此化肥生產廠家與農民考慮到成本的因素，往往不會使用低氯化肥而使用高氯離子含量的化肥。另外現在中國的耕作土壤中氯離子含量超標已經較為嚴重，即便現在開始使用低氯離子含量的化肥也不能很快的解決作物尤其是煙草中氯離子超標的問題。因此傳統的農藝措施很難改變目前煙葉中氯離子超標的問題。

隨著分子生物學技術的發展，采用分子手段去除煙草中特定的吸收氯離子的通道是解決這一問題的一種手段。目前的研究表明慢陰離子通道（SLAC）蛋白家族主要在植物陰離子（氯離子和硝酸根離子等）攝取和氣孔開閉過程中起到重要作用。目前已有在本氏煙中通過瞬時轉化的方法（VIGS）來驗證其基因家族中一個基因的功能。但因為SLAC基因是一個基因家族，會存在基因分化的可能，同時本氏煙中基因與栽培煙存在較大的差異，因此通過RNAi干擾的手段在栽培煙草中直接驗證栽培基因中內源SLAC基因功能是確定負責栽培煙草中氯離子吸收基因的關鍵。通過確定栽培煙草中氯離子吸收的關鍵基因是培育低氯離子含量煙草的基礎，因此本發明具有較大的經濟價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種煙草氯離子吸收基因NtSLAC2；第二目的在于提供所述的煙草氯離子吸收基因NtSLAC2的克隆方法；第三目的在于提供所述的煙草氯離子吸收基因NtSLAC2的應用。

本發明的第一目的是這樣實現的，所述的煙草氯離子吸收基因NtSLAC2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本發明的第二目的是這樣實現的，包括以下步驟：

A、煙草葉片cDNA合成：提取煙草RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA；

B、NtSLAC2基因的PCR擴增：以反轉錄得到的第一鏈cDNA作為模板，根據NtSLAC2基因序列設計合成特異性引物，進行PCR擴增，回收和純化PCR擴增產物，并測序。

本發明的第三目的是這樣實現的，所述的煙草氯離子吸收基因NtSLAC2在獲得低氯轉基因植株中的應用。