[發(fā)明專利]一種透明質(zhì)酸寡糖的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811346941.5
• 申請(qǐng)日: 2018-11-13
• 公開（公告）號(hào): CN109517012B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳玉娟;陳雯雯;杜國(guó)輝;劉建建;李德杰;穆淑娥;郭學(xué)平;欒貽宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華熙生物科技股份有限公司;山東華熙海御生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): C07H1/06
• 分類號(hào): C07H1/06;C07H7/033;C08B37/08;C12P19/14;C12P19/26
• 代理公司: 北京彩和律師事務(wù)所 11688
• 代理人: 劉磊;閆桑田

本發(fā)明提供一種高純度透明質(zhì)酸寡糖的制備方法，以透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸得到透明質(zhì)酸寡糖混合物；使用離子交換色譜柱對(duì)透明質(zhì)酸寡糖混合物進(jìn)行分離、脫鹽，本發(fā)明采用的填料粒徑小、流速高、柱長(zhǎng)短，可明顯縮短分離時(shí)間，使分離效率大大提高，可實(shí)現(xiàn)克級(jí)寡糖的生產(chǎn)，易于向更大生產(chǎn)規(guī)模轉(zhuǎn)化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸寡糖的制備領(lǐng)域，具體涉及一種高純度透明質(zhì)酸寡糖的制備方法。

背景技術(shù)

透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，簡(jiǎn)稱HA)又名玻璃酸，是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖(1-4)-D-D-葡萄醛酸雙糖重復(fù)單位所組成的高分子量的直鏈粘多糖。1934年由Meyer等人從牛玻璃球眼中首次提取獲得。

分子量大小對(duì)HA的生物活性影響較大，不同分子量范圍的HA表現(xiàn)出截然不同的生理學(xué)功能。高分子量的HA(Mr＞1×10⁶)由于具有較好的粘彈性、保濕性、抑制炎性反應(yīng)、潤(rùn)滑等功能，可應(yīng)用于高端化妝品行業(yè)、眼科手術(shù)黏彈劑和關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療。中等分子量的HA(介于1×10⁵-10⁶)具有良好的保濕性、潤(rùn)滑和藥物緩釋作用，可廣泛用于化妝品、滴眼液、皮膚燒傷愈合及術(shù)后防粘連。低分子量的HA和寡聚透明質(zhì)酸，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的生物活性，具有抑制腫瘤擴(kuò)散、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、促進(jìn)骨和血管生成、免疫調(diào)節(jié)等作用，且易于滲透到真皮中，免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子的激活劑。因此，小分子透明質(zhì)酸在食品保健、化妝品以及臨床醫(yī)療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

透明質(zhì)酸經(jīng)過酶解得到的產(chǎn)物一般為多種透明質(zhì)酸寡糖(oligosaccharides ofhyaluronan，簡(jiǎn)稱o-HA)的混合物，如果要制備不同糖殘基數(shù)的o-HA，必須經(jīng)過分離。o-HA是相對(duì)分子量小于10000、單糖殘基數(shù)量為2～40(一般為4～16)的HA分子片段。o-HA屬于小分子多糖，其性質(zhì)與普通HA有很大不同，甚至具有完全相反的作用。

目前透明質(zhì)酸寡糖主要通過柱色譜法進(jìn)行分離純化。由于透明質(zhì)酸本身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分離方法主要有凝膠色譜法和離子交換色譜法。凝膠色譜法主要根據(jù)各寡糖分子量的不同進(jìn)行分離。凝膠色譜所用填料都有一定排阻極限，而高分子量寡糖之間相對(duì)分子量差異較小，使其較難分離；另外對(duì)于相對(duì)低分子量的寡糖分離則仍需要較長(zhǎng)色譜柱尺寸，較低的流速，顯然不利于大規(guī)模制備。離子交換色譜法主要根據(jù)寡糖所帶羧基電荷的不同進(jìn)行分離，分子量越高，所帶羧基電荷越多，與填料結(jié)合能力越強(qiáng)，越難洗脫。

在專利文獻(xiàn)1中公開了一種利用離子交換柱實(shí)現(xiàn)單一分子量透明質(zhì)酸寡糖的制備方法，其中使用強(qiáng)陰離子交換柱HiPrep Q FF 16/10對(duì)透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸得到的透明質(zhì)酸寡糖混合物進(jìn)行分離純化。得到的寡糖HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14的產(chǎn)物純度分別為75％、64.5％、55％、43.5％、43％、40.5％，HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14的產(chǎn)物得率分別為94％、91％、88％、87.5％、85％、82％、80.5％。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：CN106399428A

發(fā)明內(nèi)容

然而，上述專利文獻(xiàn)1中以2mL/min的流速進(jìn)行洗脫，分離時(shí)間仍舊較長(zhǎng)，并不適于向更大生產(chǎn)規(guī)模的轉(zhuǎn)化，另外，仍舊有透明質(zhì)酸寡糖的純度提高以及種類擴(kuò)大的余地。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明專利采用的技術(shù)方案是：

1.一種高純度透明質(zhì)酸寡糖的制備方法，其特征在于，包括：

透明質(zhì)酸酶解步驟，以透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸得到透明質(zhì)酸寡糖混合物；

透明質(zhì)酸寡糖的分離步驟，使用離子交換色譜柱對(duì)透明質(zhì)酸寡糖混合物進(jìn)行分離，根據(jù)出峰時(shí)間依次收集各組分；和