[發明專利]一種提高煙葉提取物中氧化酶酶活的提取方法

在審

• 申請號: 201811346921.8
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109321536A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 徐國云;翟妞;周會娜;張慧;陳千思;劉萍萍;鄭慶霞;許亞龍;王晨;李晶
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N9/08
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

本申請屬于煙草代謝物技術領域，具體涉及一種提高煙葉提取物中氧化酶酶活的提取方法專利申請事宜。該方法針對新鮮煙葉中氧化酶的提取，具體包括：制備提取液（采用裂解液RIPA、緩沖液NEB或PBS）、煙葉預處理、溶液法提取等步驟。初步測定結果表明，提取液中SOD酶活得到了較好提高，可達3.7U/μg全蛋白，POD酶活可達6.3×10^?3U/μg全蛋白，而COX酶活可達5.1×10^?3U/μg全蛋白，較好達到了減少雜質蛋白干擾、提升氧化酶含量的目的。同時由于相關提取方法簡單快速、耗時較短（僅1.5 h左右），因此使得本申請具有較好的科研價值，可為相關酶活性分析及其它相關蛋白分析和研究奠定技術基礎。

技術領域

本申請屬于煙草代謝物技術領域，具體涉及一種提高煙葉提取物中氧化酶酶活的提取方法專利申請事宜。

背景技術

煙草作為一種較為特殊的經濟作物，其產量與品質直接關系到我國國民經濟的健康發展。為了研究煙草基因功能，創制新的育種材料，對煙草代謝物進行深入研究和分析顯然具有十分重要的意義。

SOD是廣泛存在于需氧生物細胞內的一族含金屬輔助因子的酶，催化O₂^-的歧化反應，生成H₂O和O₂，而H₂O₂在過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH—Px)催化下轉化為水而得以清除。因此，SOD是生物體抗氧化脅迫的關鍵酶類，其活性決定了O₂^-和H₂O₂的濃度。煙葉生長發育過程中經常會遇到干旱、低溫等環境脅迫，在這些脅迫條件下，煙苗內的內源性抗氧化劑的含量會發生顯著下降，同時細胞膜透性增大，O₂^-大量產生，積累膜脂過氧化產物，并隨環境脅迫時間的延長而增加。隨著膜脂過氧化作用的加劇，活性氧生成與清除機制的失衡，煙苗的生長發育和煙葉品質會產生不可逆轉的不良影響。

而過氧化物酶( peroxidase，POD) 與細胞色素氧化酶是生物體內另外兩種與氧化高度相關的生物酶，其中過氧化物酶( peroxidase，POD)能催化脂肪酸、芳香胺和酚類物質的氧化，是木質素合成的關鍵酶之一 ，還參與乙烯的生物合成和氧自由基的消除反應。同時，POD與植物的抗病性也有密切的關系。細胞色素氧化酶是一種高等生物呼吸鏈中的末端氧化酶，其負責催化的將電子從細胞色素C (cytc) 傳到O₂的反應是能量代謝中的主要不可逆步驟，也是線粒體呼吸控制中的主要部位。

由于氧化酶類蛋白在植物生長發育過程的重要性，因此，對于生長過程中氧化酶類酶活的準確分析，對于植物生理生長研究以及植物新品種、新材料篩選和鑒定都具有重要意義。

現有技術中，植物蛋白（包括生物酶）的提取方法主要有兩種：溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取過程中采用了變性劑，會導致部分蛋白酶結構改變并失去活性，因此沉淀法并不適合煙草葉片全蛋白的提取。而在應用溶液法進行提取時，由于不同蛋白（生物酶）特性不同，因此具體提取所選擇的提取液及提取工藝也往往缺乏可借鑒性，往往均需重新設計。而現有技術中尚未見到較好的提取氧化酶類提取方法報道。

發明內容

本申請目的在于提供一種提高煙葉提取物中氧化酶酶活酶活提取方法，從而為煙草生長代謝研究奠定一定方法學基礎。

本申請所采取的技術方案詳述如下。

一種提高煙葉提取物中氧化酶酶活的提取方法，該方法針對新鮮煙葉中氧化酶的提取，所述氧化酶主要指：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶( peroxidase，POD)和細胞色素C氧化酶（COX）；具體包括如下步驟：

（1）制備提取液，具體可采用裂解液RIPA、NEB或PBS；配方組成為：