[發明專利]一種提高煙葉提取物中氧化酶酶活的提取方法

在審

• 申請號: 201811346921.8
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109321536A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 徐國云;翟妞;周會娜;張慧;陳千思;劉萍萍;鄭慶霞;許亞龍;王晨;李晶
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N9/08
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

1.一種提高煙葉提取物中氧化酶酶活的提取方法，其特征在于，該方法針對新鮮煙葉中氧化酶的提取，具體包括如下步驟：

（1）制備提取液，具體采用裂解液RIPA、緩沖液NEB或PBS；配方組成為：

裂解液RIPA ：pH 8.0的Tris-Cl、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；

緩沖液NEB： pH 7.5的Hepes、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，PMSF、1 mM；

（2）煙葉預處理

將栽培煙草8-12葉期的新鮮煙葉研磨粉碎；

（3）溶液法提取

在步驟（2）研磨成粉煙葉樣品中加入步驟（1）中制備的提取液，震蕩混勻后，冰上靜置不少于1h；具體用量方面，研磨成粉煙葉樣品100mg，提取液用量為500μl~1mL；

靜置完成后，5000~15000rpm離心不少于20min，保留上清液，即為氧化酶的提取液。

2.如權利要求1所述提高煙葉提取物中氧化酶酶活的提取方法，其特征在于，所述氧化酶指：超氧化物歧化酶、過氧化物酶和細胞色素C氧化酶。

3.如權利要求2所述提高煙葉提取物中氧化酶酶活的提取方法，其特征在于，步驟（2）中，所述栽培煙草為K326或者NC82品種。

4.如權利要求3所述提高煙葉提取物中氧化酶酶活的提取方法，其特征在于，步驟（1）中PBS的pH=8.0、7.2或者6.0，具體組成為：

pH=8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 9.5 mM，NaH₂PO₄、0.5 mM，PMSF、1 mM；

pH=7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 7.2 mM，NaH₂PO₄、2.8 mM，PMSF、1 mM；

pH=6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 1.2 mM，NaH₂PO₄、8.8 mM，PMSF、1 mM。

5.如權利要求4所述提高煙葉提取物中氧化酶酶活的提取方法，其特征在于，

針對超氧化物歧化酶和/或過氧化物酶提取時，步驟（1）中，采用ph=8.0的PBS，步驟（3）中，提取液用量為1mL，13000 rpm離心20min；

針對細胞色素C氧化酶提取時，步驟（1）中，采用ph=8.0的PBS；步驟（3）中，提取液用量為1mL，5000 rpm離心20min。