[發明專利]一種東方巴貝斯蟲RPA分子檢測方法

有效

• 申請號: 201811346598.4
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109593870B
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 賀蘭;趙陽楠;趙俊龍;崔杰;喻龍;聶政;戰雪燕;申邦;胡敏;周艷琴;方瑞
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6844
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

1.檢測東方巴貝斯蟲線粒體COX 1基因的特異性引物對及探針在制備檢測東方巴貝斯蟲的試劑中的應用，其特征在于，所述引物對及探針的序列如下所示：

上游引物F1：5'- ATTAGAACGGAATTAAGTATGAGTGGATTGAAGAT -3'；

下游引物R1：5' - TATTGGTTGTAATAACAAACTATACAAATTTGCCC -3'；

探針：5' - ATTCTTTAATATTATGACTGGACTTTTTGGAGGTATTGGAAATTATTT -3'；

所述東方巴貝斯蟲線粒體COX 1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述引物對及探針的使用方法如下：

1）提取待測樣品的總DNA，進行重組酶聚合酶擴增反應；

2）采用側向流析試紙條檢測擴增產物。

2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述重組酶聚合酶擴增反應的體系為：29.5μL Rehydration Buffer的緩沖液，11.2 μL ddH₂O，2.1 μL上游引物，2.1 μL下游引物，2 μL DNA模板，0.6 μL探針，2.5 μL 280mM的醋酸鎂；

所述重組酶聚合酶擴增反應的條件為：30-45℃，避光，反應10-30 min。

3.如權利要求1所述的應用，其特征在于：所述下游引物R1序列的5＇端設有biotin生物素標記，所述探針序列的5＇端設有FAM羧基熒光素標記，所述探針序列的第30和31位點之間設有THE四氫呋喃標記，所述探針序列的3＇端設有SpC3封閉基團。

4.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述側向流析試紙條檢測的方法是：取50 μL的重組酶聚合酶擴增的最終反應產物2 μL，加入至含有98 μL MGCB running buffer 的1.5 mL離心管中，混勻后將側向流析試紙條放入離心管，反應3 min，僅質控線顯色為陰性樣本；檢測線及質控線均顯色為陽性樣本。