[發明專利]一種東方巴貝斯蟲RPA分子檢測方法

有效

• 申請號: 201811346598.4
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109593870B
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 賀蘭;趙陽楠;趙俊龍;崔杰;喻龍;聶政;戰雪燕;申邦;胡敏;周艷琴;方瑞
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6844
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了東方巴貝斯蟲線粒體COX 1基因在東方巴貝斯蟲分子檢測中的應用，所述東方巴貝斯蟲線粒體COX 1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，本發明還公開了一種東方巴貝斯蟲RPA分子檢測方法，屬于寄生蟲分子檢測領域。本發明以東方巴貝斯蟲線粒體COX 1基因為靶點，將重組酶聚合酶等溫擴增技術與側向流析技術相結合，實現了東方巴貝斯蟲快速檢測，該方法具有靈敏度高、特異性強、效率高等優點。

技術領域

本發明是一種東方巴貝斯蟲的重組酶聚合酶等溫擴增(Recombinase PloymeraseAmplication,RPA)分子檢測方法。

技術背景

東方巴貝斯蟲可以導致水牛巴貝斯蟲病，這是中國中部和南部地區最重要的水牛疾病之一，每年造成巨大的經濟損失。它是一種蜱傳的紅細胞內原生動物寄生蟲；該病發熱，貧血，黃疸，血紅蛋白尿等臨床特征。水牛是東方巴貝斯的唯一哺乳動物宿主。而廣泛分布于中國中部和南部的鐮形扇頭蜱是唯一已知的蜱媒介，它將寄生蟲傳播給水牛，其傳染階段是成年蜱。

盡管傳統上使用血涂片的顯微鏡檢查來診斷急性巴貝斯蟲感染，但由于該技術的低敏感性，使用顯微鏡檢查來診斷感染動物仍然具有挑戰性。血清學方法具有交叉反應以及感染及隱性感染之間難以區分等缺點。分子技術已被證明在巴貝斯蟲檢測和鑒定中非常重要，其中Caccio針對18S rRNA基因進行特異性PCR分析。之后的巢式和實時PCR測定法也有報道。然而，這些技術依賴于昂貴的設備，如熱循環儀的可用性。

重組酶聚合酶擴增(RPA)是一種等溫DNA擴增技術，與其他DNA擴增方法相比具有多項優勢，特別是在其可在非實驗室環境下應用。重組酶聚合酶反應特異性強，可在恒溫條件發生。擴增產物可以通過橫向流動試紙條檢測，具有靈活性和實用性等優點。旨在開發一種敏感，簡單，并且可以適用于偏遠地區的快速診斷技術。

發明內容

本發明的目的是提供東方巴貝斯蟲線粒體COX 1基因在東方巴貝斯蟲分子檢測中的應用，本發明的另一個目的是提供一種東方巴貝斯蟲RPA分子檢測方法，該方法以東方巴貝斯蟲線粒體COX 1基因為靶點，將重組酶聚合酶等溫擴增技術(RPA)與側向流析技術(LF)相結合，以提高檢測效率、特異性和靈敏度。

本發明的具體方案包括以下步驟：

1)引物設計：根據2014年已報道的登錄號為KF218819.1的東方巴貝斯蟲線粒體COX I基因序列(序列表SEQ ID NO：1所示)設計一對特異性引物及探針，所述的引物對的核苷酸序列如下所示：

上游引物F1：5'-ATTAGAACGGAATTAAGTATGAGTGGATTGAAGAT-3'；

下游引物R1：5'-TATTGGTTGTAATAACAAACTATACAAATTTGCCC-3'；

探針：5＇-ATTCTTTAATATTATGACTGGACTTTTTGGAGGTATTGGAAATTATTT-3'

上述引物對的核苷酸序列已經采用專用軟件PatentIn3.1處理成專利程序的核苷酸序列計算機可讀形式副本。這些引物對在序列表中被依次命名為SEQ ID NO：2至SEQ IDNO：4。

2)提取牛血液樣品中的總DNA，進行重組酶聚合酶擴增反應。

3)采用側向流析試紙條檢測擴增產物。

所述下游引物R1序列的5＇端設有biotin生物素標記，所述探針序列的5＇端設有FAM羧基熒光素標記，所述探針序列的第30和31位點之間設有THE四氫呋喃標記，所述探針序列的3＇端設有SpC3封閉基團。