[發明專利]一種用于檢測KIAA1549-BRAF融合基因的熒光原位雜交探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201811346321.1
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109234400B
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 呂玉琦;李先洋;李倩;李雪梅;葉倫;程弘夏;陳剛
• 申請（專利權）人: 武漢康錄生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6841;C12N15/11
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 徐曉琴

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種用于檢測KIAA1549?BRAF融合基因的熒光原位雜交探針及其制備方法和應用。所述熒光原位雜交探針包含兩個探針庫，KIAA1549基因雜交探針庫：探針的起始位置設計在KIAA1549基因斷裂點左右各200Kb范圍內，探針向著絲粒方向延伸，探針的長度為300～1000Kb；BRAF基因雜交探針庫：探針的起始位置設計在BRAF基因斷裂點左右各200Kb范圍內，探針向端粒方向延伸，探針的長度為300～1000Kb。本發明在兩個融合基因外區域分別設計探針，實現了在同一條染色體上兩個距離比較近的融合基因檢測，能夠在細胞水平上很直觀的反應兩個基因的融合狀態。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種用于檢測KIAA1549-BRAF融合基因的熒光原位雜交探針及其制備方法和應用。

背景技術

毛細胞星形細胞瘤(PA)是一種WHO分級為Ⅰ級的顱內原發腫瘤，在兒童神經外科中是最為常見的神經膠質瘤，統計其約占腦部腫瘤的25％。KIAA1549基因和BRAF基因均位于7號染色體q34區域，BRAF基因的串聯重復導致了KIAA1549/BRAF基因融合，在毛細胞型星形細胞瘤中高發(60％～80％)。根據KIAA1549及BRAF基因互相融合的位置不同，日前已報道5種不同融合變體，分別為：KIAA1549ex16-BRAF ex9，KIAA1549ex15-BRAF ex9，andKIAA1549ex16-BRAF ex11，KIAA1549ex18-BRAF ex10和KIAA1549ex19-BRAF ex9；前三種依次占全部變異數目的45％，28％和5％，后兩種相對較少。盡管產生上述融合的內在機制目前仍不十分清楚，但不同類型的KIAA1549-BRAF融合突變被認為具有相同的功能。

目前為止，對于PA發生發展中的分子機制仍未有非常明確的結論，在PA患者的染色體7q34中檢測到異常的基因拷貝，全基因組的高通量測序技術顯示絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路異常，該通路的異常與KIAA1549基因和BRAF基因互相融合相關。越來越到的文獻報道，KIAA1549:BRAF融合基因已被用作毛細胞星形細胞瘤的診斷標志物。此外2015年度“中國中樞神經系統膠質瘤診斷與治療指南”中推薦KIAA1549:BRAF融合基因檢測作為毛細胞星形細胞瘤的診斷標志物。

該融合基因的檢測方法目前有4種，全基因組測序(WGS)、轉錄組測序(RNA-seq)、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和熒光原位雜交(FISH)，由于前兩種方法成本高、對樣本要求高使其在大多數實驗室難以廣泛推行；后兩種方法也是“中國中樞神經系統膠質瘤診斷與治療指南”中推薦的檢測方法，由于KIAA1549:BRAF基因融合有多種形式，PCR技術檢測相對比較困難且無法檢測出未報道的融合方式。熒光原位雜交(FISH)技術對于融合基因的檢測可以非常直觀的反應兩種基因的融合狀態，對于已報道不同融合類型和未報道的融合方式均可以檢出，克服了PCR技術的不足。FISH技術對于KIAA1549:BRAF基因融合的檢測應該是首選，但由于兩個基因均位于7號染色體q34區域，且染色體位置距離較近，因此常規FISH熒光探針很難檢測該融合基因。目前針對該融合基因主要有兩種檢測探針：BRAF斷裂探針和KIAA1549/BRAF融合基因探針。由于已有BRAF斷裂探針設計區域分別在BRAF基因斷裂區域左右各550Kb范圍，當BRAF基因斷裂后，信號點之間距離為1.4Mb區域，該距離比較近，無法區分開斷裂信號點；而KIAA1549/BRAF融合基因探針設計區域(圖2)分別兩個基因發生融合區域，斷裂融合后在兩個信號點中間多出一個融合信號，但三個信號點間距離約為1.0Mb區域，同樣無法區分開斷裂信號點。因此，目前常規BRAF斷裂探針和KIAA1549/BRAF融合基因探針均不能完全區分陽性和陰性樣本。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，目的在于提供一種用于檢測KIAA1549-BRAF融合基因的熒光原位雜交探針及其制備方法和應用。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：