[發(fā)明專利]一種快速測試納米顆粒對藻類活性影響的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811341847.0 | 申請日： | 2018-11-12 |
| 公開（公告）號： | CN109536566B | 公開（公告）日： | 2022-02-25 |
| 發(fā)明（設計）人： | 曹文斌;莊思濛;匡建磊;孫芃;王法國;劉文秀;李林彬 | 申請（專利權(quán)）人： | 北京科技大學 |
| 主分類號： | C12Q1/02 | 分類號： | C12Q1/02 |
| 代理公司： | 北京市廣友專利事務所有限責任公司 11237 | 代理人： | 張仲波 |
| 地址： | 100083*** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 快速 測試 納米 顆粒 藻類 活性 影響 方法 | ||
本發(fā)明涉及一種能快速準確測試納米顆粒作用下的藻細胞活性的方法。其步驟為：藻液的培養(yǎng)制備及實驗溶液的配置；藻類生長抑制或滅活試驗，試驗期間每隔固定時間后將試驗后的藻液100～400uL滴入消毒后的細胞培養(yǎng)板，并取平行樣；向孔板藻液加入藻液體積1/10的細胞增殖試劑，在暗處孵育4～12h，使細胞貼壁；吸取上清液在450nm處用酶標儀或分光光度計檢測吸光度(OD)值。該法通過可溶性甲瓚的吸光度測定細胞線粒體酶活性，可間接反映細胞增殖活性，避免納米顆粒對計數(shù)的干擾，精度較高，可在藻類抑制及滅除測試中作為有效參考值。本方法可用于測試污廢水、河水、各類循環(huán)水、培養(yǎng)液等各種水體中納米顆粒對包括藍藻門、綠藻門在內(nèi)的大多數(shù)藻類的作用效果。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種納米顆粒對藻類活性影響的檢測方法，可以快速評價納米顆粒對藻類的抑制和殺滅效果，便于材料性能的優(yōu)化。
背景技術(shù)
藻類作為一種簡單的單細胞生物在食品、醫(yī)藥及環(huán)境領(lǐng)域都有較高的利用價值的同時，如藍藻藻華、赤潮等藻類爆發(fā)卻也會給水體生態(tài)帶來災難。研究證明，納米材料對藻類生物可能存在毒性，對水體生態(tài)的修復起積極作用，但納米材料對藻類的作用效果需使用一種較為簡便準確的方法進行評價?，F(xiàn)有的藻類細胞活性檢測主要參照細胞體外毒性測試標準，如ISO1442:1999和BS EN ISO8692：2004，但此類標準均未明確給出納米材料的藻類細胞毒性測試方法，且均采用細胞濃度值作為細胞活性標準，忽視了納米顆粒引起的絮凝對結(jié)果造成的影響，且無法分辨活細胞和死亡細胞。部分文獻使用熒光染色法計數(shù)雖可分辨活、死細胞，但對設備要求較高，且無法量化細胞的活性；專利(CN101201312A)發(fā)明了一種中性紅染色法，不需用熒光試劑染色，但卻無法避免納米顆粒物的干擾，絮凝沉降的藻細胞仍具有增殖能力；葉綠素a測試法與細胞活性線性相關(guān)度較好，但當細胞活性負增長時其值與葉綠素含量相關(guān)性較差，且葉綠素在極端脅迫條件(強光、強酸強堿、高溫)下易分解，故該法只適用于溫和條件下的生長抑制實驗；細胞增殖試劑法較為精確，可避免各種非可溶性雜質(zhì)的干擾，但如MTT法等均較少藻類測試中使用，一方面因為MTT法產(chǎn)生的甲瓚不可溶，需將細胞溶解，步驟復雜，另一方面MTT法所用增殖劑的副產(chǎn)物有毒，藻類等需長時間測試，對實驗結(jié)果及實驗人員身體健康不利。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題，采用一種高可溶性四唑鹽利用細胞培養(yǎng)的手段檢測藻細胞的活性，該方法操作簡便，所需儀器簡單，精度高，避免了不可溶雜質(zhì)對實驗結(jié)果的影響，比細胞濃度、葉綠素含量更便捷準確的反映了藻細胞活性的變化，更能精確地表現(xiàn)納米顆粒對藻細胞活性的影響。適用藻細胞范圍廣，且可用于生長抑制實驗及藻類去除試驗中細胞活。
本發(fā)明中的測試方法通過以下步驟實現(xiàn)：
(1)藻類的培養(yǎng)及生長抑制測試可參考標準ISO1442:1999和BS EN ISO8692：2004。
(2)將培養(yǎng)至對數(shù)期并經(jīng)饑餓處理24h的藻類加入水體中，保證生長抑制實驗保證藻細胞密度不低于104cell/ml。去除實驗保證細胞密度不低于106cell/ml。
(3)設定光源為自然光、LED可見光，紫外光等，生長抑制實驗中可見光光照強度維持在液面處2000～10000Lux；去除實驗中如需光照可設定紫外光輻照1～10mW/cm2，可見光強度為2～15mW/cm2，光照時間根據(jù)實驗要求決定，若為異養(yǎng)生長則可減少周期光照時間，自養(yǎng)生長需保證每個周期12h以上的光照時間，去除實驗光照時間建議在0～24h。實驗溫度可設置在25～35℃之間。
(4)生長抑制實驗取樣間隔為24h，藻類去除實驗取樣間隔為1-6h。將取樣后的藻液更換新的培養(yǎng)基，每次取100-400uL加入到孔板中，每組設置至少6個平行樣，并加入1/10體積的細胞增殖試劑。在25～35℃溫度下孵育4-12h，若光照會產(chǎn)生還原性物質(zhì)，需在黑暗條件下孵育。
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