[發明專利]一種快速測試納米顆粒對藻類活性影響的方法

有效

• 申請號: 201811341847.0
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109536566B
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發明（設計）人: 曹文斌;莊思濛;匡建磊;孫芃;王法國;劉文秀;李林彬
• 申請（專利權）人: 北京科技大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京市廣友專利事務所有限責任公司 11237
• 代理人: 張仲波

1.一種能快速準確測試納米顆粒作用下的藻細胞活性的方法，

其特征在于包括的步驟如下：

(1)藻類的培養及生長抑制測試參考標準ISO1442:1999和BS EN ISO8692：2004；

(2)將培養至對數期并經饑餓處理24h的藻類加入水體中，保證生長抑制實驗保證藻細胞密度不低于10⁴cell/ml；去除實驗保證藻細胞密度不低于10⁶cell/ml；

(3)設定光源為自然光、LED可見光，紫外光，生長抑制實驗中可見光光照強度維持在液面處2000～10000Lux；去除實驗中如需光照可設定紫外光輻照1～10mW/cm²，可見光強度為2～15mW/cm²，光照時間根據實驗要求決定，若為異養生長則可減少周期光照時間，自養生長需保證每個周期12h以上的光照時間，去除實驗光照時間在0～24h；實驗溫度設置在25～35℃之間；

(4)生長抑制實驗取樣間隔為24h，藻類去除實驗取樣間隔為1-6h；將取樣后的藻液更換新的培養基，每次取100-400uL加入到孔板中，每組設置至少6個平行樣，并加入1/10體積的細胞增殖試劑；在25～35℃下孵育4-12h，若光照會產生還原性物質，需在黑暗條件下孵育；所述細胞增殖試劑為一種高度水溶性的四唑鹽；

(5)孵育完畢后，取上清液在酶標儀或分光光度計下讀數，波長選擇為450nm，并用公式計算抑制率，生長抑制實驗的理論抑制率為正，去除實驗的理論抑制率為負。

2.根據權利要求1所述能快速準確測試納米顆粒作用下的藻細胞活性的方法，其特征在于步驟(4)所述生長抑制實驗或藻類去除實驗為：水體過濾、消毒后，加入試驗藻液及納米顆粒物后進行試驗；抑制實驗培養時間72～144h，滅活實驗時間在1～96h之間，具體根據實際實驗效果選擇。

3.根據權利要求1所述能快速準確測試納米顆粒作用下的藻細胞活性的方法，其特征在于步驟(4)所述孵育是：每隔固定時間取100～400uL藻液及10～40uL細胞增殖活性劑至孔板，若藻液濃度較高或過低可稀釋濃縮至10⁴cell/ml，并更換培養液，每組樣品至少取3個平行樣，孵育4～12h使細胞貼壁后可以進行讀數。

4.根據權利要求1所述能快速準確測試納米顆粒作用下的藻細胞活性的方法，其特征在于步驟(5)所述讀數：吸取孔板中的上清液，用酶標儀或分光光度計在450nm處讀數，并取平均值；利用所測值根據公式計算納米顆粒對藻類的抑制率或滅活率；

抑制率：

滅活率：

A_納指包含納米顆粒、藻類及培養液的實驗組；A_對為含納米顆粒、培養液但不含藻細胞的對照組；A_藻只含藻液、培養液；A_空為只含培養基的空白組。

5.根據權利要求3所述能快速準確測試納米顆粒作用下的藻細胞活性的方法，其特征在于所用的細胞增殖試劑為(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽中的一種；四唑鹽可與呼吸作用產生的脫氫酶反應生成水溶性甲瓚，不需要洗滌溶解操作即可間接反映細胞增殖活性；所述在常溫下至少可保存1個月，4℃保存12個月以上；每次使用藻液體積的1/10即可；測試結果可排除納米顆粒及還原性物質帶來的影響，不僅可用于納米材料對藻類的生長抑制測試，還可用于藻類滅活測試。

6.根據權利要求3或5所述能快速準確測試納米顆粒作用下的藻細胞活性的方法，其特征在于所述細胞增殖試劑為CCK-8或WST-1。

7.根據權利要求1或3所述能快速準確測試納米顆粒作用下的藻細胞活性的方法，其特征在所述于孵育步驟中藻細胞的孔板接種密度需保證在10⁴～10⁵cell/ml，孵育后吸光度讀數與細胞活性線性相關性最好。