[發明專利]一種雙控延遲裂解性質粒及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201811340755.0
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109402155A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 廖何斌;郭曉蘭;徐磊;馬強;廖濤;鐘曉武
• 申請（專利權）人: 川北醫學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙) 51265
• 代理人: 黎照西

本發明提供一種具有雙控延遲裂解的質粒系統及其質粒的構建方法與應用。本發明的雙控延遲裂解性質粒含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。本發明還提供了上述質粒的構建方法，將該質粒用于由細菌介導的疫苗遞呈或由細菌介導的分子藥物治療方面的應用，初步實現了細菌的雙控延遲裂解，可以實現在含有誘導劑(阿拉伯糖)時正常生長；在不含有誘導劑時，細菌在低濃度正常生長，在高濃度時細菌開始裂解。一方面使之對于宿主更加安全，另一方面可以有效的釋放細菌介導的疫苗或分子藥物等，并取得更好的免疫效果和治療效果，具有極大的應用前景。

技術領域

本發明屬于基因治療載體技術領域，涉及質粒及其構建與應用，具體涉及一種雙控延遲裂解性質粒及其構建方法與應用。

背景技術

質粒是一種遺傳因子，是細胞染色體外一種很小的環狀DNA分子，其能夠進行自主復制，不具有胞外期，其并非是宿主細胞的生長、代謝、繁殖等生命活動所必需，但能賦予宿主細胞某些特殊的屬性和功能，如對抗生素的耐受性、對有毒化合物的降解或利用等。現有研究表明，自然界中的許多現象，如微生物對異生體的降解或對重金屬的抗性等，以及微生物的功能、特性變化和基因進化等生命現象都往往與質粒有關。

目前對于質粒所進行的研究已經相當普遍和深入，對于質粒的構建方法也有很多種，方法已日漸成熟，目前發現的有著名的降解性質粒如TOL、NAH等，抗性質粒如ColE1、F因子等，研究內容涉及質粒的復制機理，質粒上攜帶的功能基因的表達、調控等方面。新的質粒的發現與構建仍是目前生命科學的前沿課題與研究熱點。

質粒的另一個重要作用是可以作為基因工程的載體，由于質粒能夠在適當的宿主細胞中進行自我復制，并在大多數情況下不會對寄主造成損傷，可以很方便地將整合到自身的外源基因引入到目前受體細胞內，因此質粒通常可用作目前基因的克隆和表達載體。

針對于該方面的應用，對于外源基因的表達在實現調控裂解方面進行了一些研究，但是目前調控的手段都較單一，尚無能夠很好實現多重調控裂解的方法。

發明內容

本發明的目的就是為了解決上述技術問題，而提供一種具有雙控延遲裂解的質粒系統及其質粒的構建方法與應用。該雙控延遲裂解性質粒受到兩種調控作用，其一是群體感應啟動子Pluxi調控，當細菌濃度達到閾值時，細菌發生裂解；其二是受阿拉伯糖(ara)調控，在含有ara環境時，lacI表達并與lacO結合，從而細菌裂解蛋白SRRZ表達受抑制；在不含ara時，LacI不表達，細菌蛋白表達僅受Pluxi控制。將該質粒應用于由細菌介導的疫苗遞呈或由細菌介導的分子藥物治療方面，能夠實現細菌在體外培養是，加入ara，可以正常生長；在體內沒有ara環境下，低濃度時正常生長，在高濃度使細菌開始裂解。初步實現了細菌的雙控延遲裂解，在基因治療方面具有廣闊的前景。

本發明的目的之一是提供一種雙控延遲裂解性質粒，所述質粒含有如SEQ IDNO.1所示的基因序列。

進一步的是，所述質粒含有araC-Para調控蛋白基因、SRRZ裂解基因、三個lacO操縱序列，群體感應系統啟動子Pluxi及相關蛋白LuxI/LuxR的編碼基因

進一步的是，上述質粒還含有抗性基因和復制起始位點，如氨芐青霉素抗性基因Ampr和ori起始位點。

本發明的目的之二是提供上述雙控延遲裂解性質粒的構建方法，其具體構建步驟如下：

(1)以12pHB質粒為模板進行擴增，在其Pluxi啟動子后面加上一個乳糖操縱子的lacO操縱序列，得到5pHB質粒；所述12pHB質粒的序列表如SEQ ID NO.2所示，其是在pUC57質粒中引入一段核心序列；

(2)以5pHB質粒為模板進行擴增，在GFP綠色熒光蛋白后面引入PlacI-LacI序列，得到6pHB質粒；