[發明專利]一種雙控延遲裂解性質粒及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201811340755.0
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109402155A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 廖何斌;郭曉蘭;徐磊;馬強;廖濤;鐘曉武
• 申請（專利權）人: 川北醫學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙) 51265
• 代理人: 黎照西

1.一種雙控延遲裂解性質粒，其特征在于，所述質粒含有如SEQID NO.1所示的基因序列。

2.根據權利要求1所述的雙控延遲裂解性質粒，其特征在于，所述質粒含有araC-Para調控蛋白基因、SRRZ裂解基因、三個lacO操縱序列和群體感應系統啟動子Pluxi及相關蛋白LuxI/LuxR的編碼基因；所述質粒還含有抗性基因和復制起始位點。

3.一種如權利要求1或2所述雙控延遲裂解性質粒的構建方法，其特征在于，其具體構建步驟如下：

(1)以12pHB質粒為模板進行擴增，在其Pluxi啟動子后面加上一個乳糖操縱子的lacO操縱序列，得到5pHB質粒；所述12pHB質粒的序列表如SEQ ID NO.2所示，其是在pUC57質粒中引入一段核心序列；

(2)以5pHB質粒為模板進行擴增，在GFP綠色熒光蛋白后面引入PlacI-LacI序列，得到6pHB質粒；

(3)以6pHB質粒為模板進行擴增，在lacO操縱序列下游再引入一個lacO操縱序列，得到6-2pHB質粒；再以6-2pHB質粒為模板，重復上次操作，得到6-3pHB質粒；

(4)用araC-Para替代PlacI，得到7pHB質粒；

(5)用SRRZ替代GFP，得到8pHB質粒，即為目標產物雙控延遲裂解性質粒。

4.根據權利要求3所述雙控延遲裂解性質粒的構建方法，其特征在于，步驟(1)中，是以5FG3P1/5FG3P2和5FG1P1/5FG1P2為引物，擴增出片段5FG3和5FG1；以pRE112為模板，以5FG2P1/5FG2P2為引物，擴增出片段5FG2；將3個片段分別進行純化回收，用無縫連接試劑盒對純化后的3個片段進行連接，連接產物轉化到大腸桿菌DH5α，于LB+Amp培養基進行篩選，經PCR鑒定的陽性克隆提取質粒，送往生工測序。

5.根據權利要求3所述雙控延遲裂解性質粒的構建方法，其特征在于，步驟(2)中，是以5FG1P1/5FG1P2，5FG2P1/5FG2P2和5FG3P1/6FG3P2為引物，擴增片段5FG1、5FG2和6FG3；以pET32a為模板，以6FG4P1/6FG4P2為引物，擴增片段6FG4；4個片段分別用DNA純化試劑盒純化回收，用無縫連接試劑盒對上述純化的4個片段進行連接，連接產物轉化到大腸桿菌DH5α，于LB+Amp培養基進行篩選，經PCR鑒定的陽性克隆提取質粒，送往生工測序。

6.根據權利要求3所述雙控延遲裂解性質粒的構建方法，其特征在于，步驟(3)中，所述6-2pHB質粒是以62FG1P1/62FG1P2和62FG2P1/62FG2P2為引物，用PCR試劑盒擴增片段62FG1和62FG2，2個片段分別用DNA純化試劑盒純化回收，62FG1和62FG2均用限制性內切酶NotI和BglII消化，消化產物用DNA純化試劑盒純化回收，再用T4DNA連接酶進行連接，連接產物轉化到大腸桿菌DH5α，于LB+Amp培養基進行篩選，經PCR鑒定的陽性克隆提取質粒，送往生工測序。

7.根據權利要求3所述雙控延遲裂解性質粒的構建方法，其特征在于，所述6-3pHB質粒是以62FG1P1/63FG1P2和63FG2P1/62FG2P2為引物，擴增片段63FG1和63FG2，2個片段進行純化回收，然后用限制性內切酶NotI和EcoRI消化，消化產物用DNA純化試劑盒純化回收，再用T4DNA連接酶進行連接，連接產物轉化到大腸桿菌DH5α，于LB+Amp培養因進行篩選，經PCR鑒定的陽性克隆提取質粒，送往生工測序。