[發明專利]一種煙草抗病毒調控基因篩選方法及應用

在審

• 申請號: 201811340502.3
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109610009A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 任學良;蔡新忠;郭玉雙;王仁剛;耿召良
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6806;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82;C12Q1/70;C12Q1/18
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明提供了一種煙草抗病毒調控基因篩選方法及應用，該方法首先以病毒誘導的基因沉默VIGS載體為目的載體，構建煙草cDNA文庫，進行均一化處理后獲取可直接用于基因沉默篩選分析的VIGS?cDNA文庫；將VIGS?cDNA文庫質粒轉化至農桿菌，獲得農桿菌文庫；將農桿菌文庫涂板培養獲取單菌落，對每個單菌落分別進行VIGS沉默分析，篩選獲得抗病毒相關菌落；對篩選獲得的抗病毒相關菌落對應的基因進行測序分析，并對獲得的序列進行同源性分析和功能預測，獲取抗病毒調控基因。本發明方法操作簡便，無需構建轉基因植株或突變體，耗時短，篩選全面效率高，特別適用于突變致死基因的篩選，應用前景廣闊。

技術領域

本發明屬于植物抗病調控基因篩選及應用技術領域，涉及一種煙草抗病毒調控基因篩選方法及應用。

背景技術

植物cDNA文庫是指一個植物物種所有cDNA的集合。這些cDNA通常被插入一個載體，轉化至大腸桿菌中混合保存。構建完成后，可供隨時選取使用。另外，通過選擇使用不同的文庫構建載體，可以進行不同的植物功能基因組學研究。比如用植物表達載體構建的文庫，可以用于植物體內瞬時過表達分析，篩選特定目標功能的調控基因。因此，植物cDNA文庫的利用是植物功能基因組學研究的基本研究手段，也是規模化篩選、分離和克隆目的調控基因的主要途徑之一。植物cDNA文庫的構建步驟主要包括植物組織總RNA提取，mRNA純化，反轉錄，連入載體，均一化處理，連接產物的細菌轉化，質粒提取，PCR和酶切檢驗，容量和重組率分析等。

植物基因功能通常通過比較分析基因的超常規表達與正常表達情況下的表型(Phenotype)或功能發揮情況來判斷。基因的超常規表達包括高于正常水平的表達和低于正常水平的表達兩大類。高于正常水平的表達主要為超表達/過表達(Over-expression)，主要通過連接一個強啟動子來驅動目的基因表達的方式來達到。低于正常水平的表達主要通過RNA干擾(RNA interfering,RNAi)、基因敲低(Knock-down)和基因敲除(Knock-out)等方式來達到。超表達通過構建和轉化一個含有同一序列片段相反方向插入一個內含子或其它不表達的序列形成的發卡結構來實現，結果是目的基因表達的降低。基因敲低還可以通過病毒誘導的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)來實現。基因敲除(Knock-out)則通過在植物基因組中的目的基因中插入一個長的非植物序列或切除目的基因等方式來達到，結果是目的基因表達的完全或近乎完全的抑制。對于單個基因，只要構建基因超表達植株和/或超表達植株、基因敲除突變體，比較這些植株的表型和性狀與野生型/正常植株的差異，就能明確目的基因對該性狀的調節功能。但對于亞組學和組學水平的規模化基因功能分析，則需要構建所有基因的超表達庫、突變體庫或VIGS文庫方可達到篩選和分離目標基因的目的。

由于外源基因的導入，導致植物中與該外源基因一致及與之高度同源的植物內源基因的轉錄本積累受到抑制的現象稱為轉錄后基因沉默(post-transcriptional genesilencing，PTGS)。“病毒誘導的基因沉默”(virus-induced gene silencing，VIGS)是植物中研究最廣泛的PTGS現象。VIGS現象本來是植物抗病毒侵染的一種自然機制。但近年來，已被開發成為一項快速基因功能鑒定新技術。只需將植物目的基因片段插入病毒載體，構建成重組病毒，侵染植物后即可用于抑制與插入片段高度同源的植物內源目的基因的表達，從而探明該基因功能。經過數年的研究，該思路已發展成一項可以快速高通量研究植物基因功能的成熟技術，在植物功能基因組學的研究中正得到越來越廣泛的應用。

目前已有的用于功能喪失(loss-of-function)研究的方法主要包括化學突變分析，轉座子或農桿菌T-DNA插入突變分析。這些方法在擬南芥等少數模式植物基因功能研究中非常有效，但在其他植物中尚未能大規模的應用。另外，抑制目的基因表達的技術還包括反義RNA技術，RNAi技術以及化學制劑誘導性基因沉默技術。所有這些技術均需構建轉基因植株。VIGS技術與現有這些技術相比，具有以下優點或特點：