[發明專利]一種煙草抗病毒調控基因篩選方法及應用

在審

• 申請號: 201811340502.3
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109610009A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 任學良;蔡新忠;郭玉雙;王仁剛;耿召良
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6806;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82;C12Q1/70;C12Q1/18
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

1.一種煙草抗病毒調控基因篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以VIGS載體為目的載體，構建煙草cDNA文庫，進行均一化處理后獲取可直接用于基因沉默篩選分析的VIGS-cDNA文庫；

(2)cDNA文庫-VIGS分析：將構建完成的VIGS-cDNA文庫質粒轉化至農桿菌，獲得農桿菌文庫，將農桿菌文庫涂板培養獲取單菌落，對每個單菌落分別進行VIGS沉默分析；

(3)抗病毒調控基因的篩選：對cDNA文庫各菌落的VIGS沉默植株進行抗病毒分析，篩選獲得抗病毒相關菌落；

(4)抗病毒調控基因的鑒定：對篩選獲得的抗病毒相關菌落對應的基因進行測序分析，并對獲得的序列進行同源性分析和功能預測，獲取抗病毒調控基因。

2.如權利要求1所述的煙草抗病毒調控基因篩選方法，其特征在于，步驟(1)構建煙草cDNA文庫的方法是：

1)提取煙草總RNA，獲得煙草mRNA，構建DSN均一化cDNA初級文庫，將均一化處理的cDNA通過BP重組反應克隆入載體，然后轉化感受態細胞，通過涂板和單克隆檢測，分析文庫的容量和均一化效果；

2)進行VIGS次級文庫的構建：提取步驟1)得到的cDNA初級文庫質粒，將得到的初級文庫質粒稀釋后通過LR重組反應克隆入VIGS載體；通過涂板和單克隆檢測，分析文庫的容量和重組率；

3)鑒定獲取容量大和重組率高的煙草VIGS-cDNA文庫。

3.如權利要求2所述的煙草抗病毒調控基因篩選方法，其特征在于，VIGS載體為pTRVG，得到的VIGS-cDNA文庫為pTRVG-cDNA文庫。

4.如權利要求1所述的煙草抗病毒調控基因篩選方法，其特征在于，步驟(2)對每個單菌落分別進行VIGS沉默分析的方法為：

1)吸取部分農桿菌菌液涂板培養，同時培養轉化了的農桿菌文庫；挑取單菌落，接種于含抗生素的液體培養基中進行培養，收集菌體細胞，重懸至OD₆₀₀值為2，恢復培養后，按1：1(V:V)比例將轉化了的農桿菌和插入目的基因片段的VIGS-cDNA文庫轉化菌進行混合；

2)植株的浸潤接種：將混合農桿菌液浸潤苗齡為20-25d的煙草上部完全伸展的葉片，以浸潤轉化了的農桿菌和VIGS-eGFP農桿菌的混合菌液作為對照；

3)將浸潤接種后的煙草培養，讓目的基因進行有效的沉默。

5.如權利要求1-4任一所述的煙草抗病毒調控基因篩選方法，其特征在于，步驟(3)的抗病毒分析方法為：沉默處理兩周后，對cDNA文庫各菌落的VIGS沉默植株分別進行抗病毒分析，接種煙草病毒，接種后，觀察和記錄病毒病害癥狀，獲取沉默后病毒病害癥狀嚴重度發生顯著改變的菌落，這些菌落對應的基因即為抗病毒調控基因的候選基因。

6.如權利要求5所述的煙草抗病毒調控基因篩選方法，其特征在于，所述病毒為馬鈴薯Y病毒和煙草花葉病毒。

7.如權利要求1-4任一所述的煙草抗病毒調控基因篩選方法，其特征在于，步驟(4)對篩選獲得的抗病毒相關菌落對應的基因進行測序分析，獲取這些基因的序列，并對這些序列進行煙草和其它植物基因組數據庫的BLAST分析、保守結構域分析，預測基因功能，從而獲取抗病毒調控基因。

8.權利要求1-7任一所述的煙草抗病毒調控基因篩選方法在煙草病毒病防治中的應用。

9.權利要求1-7任一所述的煙草抗病毒調控基因篩選方法在制備抗病毒轉基因煙草中的應用。

10.權利要求1-7任一所述的煙草抗病毒調控基因篩選方法在獲取煙草抗病毒調控基因并用于煙草種質資源改良中的應用。