[發(fā)明專利]一種水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811339926.8
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109402236A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊隆維;熊亞俊;王小文;華美;鐘育海;劉迪權(quán);郭發(fā)吉;覃竹山;徐建龍;徐俊英;譚小菊;程蘇
• 申請（專利權(quán)）人: 長江大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;G16B5/00
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 包曉靜

本發(fā)明屬于分子植物學領(lǐng)域，公開了一種水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi?25的檢測方法，所述檢測方法：取新鮮水稻植株，在?80℃進行凍干處理，研磨成細粉狀，利用植物基因組DNA提取試劑盒提取水稻植株的DNA；引物：檢測Pi25的引物對為CAP1F/R的引物序列，限制性內(nèi)切酶為HincII；基因組DNA提取：用CTAB法提取水稻基因組DNA，1％的瓊脂糖凝膠檢測水稻基因組DNA；PCR擴增：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，73℃延伸30s，35個循環(huán)；73℃延伸3min；酶切：取15μL的利用CAP1引物PCR擴增產(chǎn)物，加入3μL酶切緩沖液，1.5μLHincⅡ限制性內(nèi)切酶，補ddH₂O 5μL至20μL體系，37℃對產(chǎn)物酶切位點進行酶切；電泳完成后，用凝膠成像系統(tǒng)對電泳膠進行照相。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子植物學領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法。

背景技術(shù)

目前，業(yè)內(nèi)常用的現(xiàn)有技術(shù)是這樣的：

稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度減產(chǎn)，嚴重時甚至會造成顆粒無收。稻瘟病又名稻熱病，俗稱火燒瘟、吊頭瘟、掐頸瘟等，是世界性的重要稻病，世界各稻區(qū)均可發(fā)生，其中以葉部、節(jié)部發(fā)生為多，發(fā)生后可造成不同程度減產(chǎn)，尤其穗頸瘟或節(jié)瘟發(fā)生早而重，可造成白穗以致絕產(chǎn)。目前，稻瘟病可能發(fā)生在各域內(nèi)的任何年頭、任何季節(jié)。稻瘟病是真菌寄生引起，病菌發(fā)育最適溫病為25℃～28℃，高濕有利分生孢子形成飛散和萌發(fā)，而高濕度持續(xù)達一晝夜以上，則有利于病害發(fā)生流行。土壤溫度低，陰雨連綿，日照不足有利于發(fā)病，大面積種植高優(yōu)品種，抗病性差極易導致大面積發(fā)病。偏施、遲施氮肥，均易誘發(fā)稻瘟病。

源自秈稻品種谷梅2號的抗稻瘟病主效基因Pi-25，Pi-25定位于水稻第6染色體標記A7和RG456之間，對中國稻瘟菌菌系92-183(小種ZC15)有較強的葉瘟和穗瘟抗性。

現(xiàn)有的技術(shù)中，通常根據(jù)抗瘟表現(xiàn)對其進行判斷，主要是水稻田間的自然鑒定、人工接種鑒定，工作量大，鑒別難度大、準確性差、研究人員室外工作時間長；其次采用分子標記輔助選擇進行抗病育種時，所選用的多是與抗病基因連鎖的SSR標記，該方法易造成假陽性的判斷。綜上，現(xiàn)有方法浪費大量的人力物力、工作量大、鑒別難度大、準確率低。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：

(1)現(xiàn)有的技術(shù)中，通常根據(jù)抗瘟表現(xiàn)對其進行判斷，主要是水稻田間的自然鑒定、人工接種鑒定，工作量大，鑒別難度大、準確性差、研究人員室外工作時間長；

(2)采用分子標記輔助選擇進行抗病育種時，所選用的多是與抗病基因連鎖的SSR標記，該方法易造成假陽性的判斷，鑒別不準確。

(3)現(xiàn)有技術(shù)中采用的PCR擴增儀在工作參數(shù)受溫度、濕度的影響易波動，使得擴增的DNA質(zhì)量差；電泳儀受電壓的影響，出現(xiàn)波動引起電泳膠帶出現(xiàn)模糊的現(xiàn)象，影響膠帶質(zhì)量；凝膠成像系統(tǒng)對電泳膠進行照相處理時，照片的清晰度不佳，電泳條帶不清楚，影響對于結(jié)果的查看與分析。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法，

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法，所述水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法包括：

步驟一：取新鮮水稻植株，在-80℃進行凍干處理，研磨成細粉狀，利用植物基因組DNA提取試劑盒提取水稻植株的DNA；

步驟二：引物：檢測Pi25的引物對為CAP1F/R的引物序列，限制性內(nèi)切酶為HincII；

步驟三：基因組DNA提取：用CTAB法提取水稻基因組DNA，1％的瓊脂糖凝膠檢測水稻基因組DNA；