[發明專利]一種水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法

在審

• 申請號: 201811339926.8
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109402236A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 楊隆維;熊亞俊;王小文;華美;鐘育海;劉迪權;郭發吉;覃竹山;徐建龍;徐俊英;譚小菊;程蘇
• 申請（專利權）人: 長江大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;G16B5/00
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 包曉靜

1.一種水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法，其特征在于，所述水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法包括：

步驟一：取新鮮水稻植株，在-80℃進行凍干處理，研磨成細粉狀，利用植物基因組DNA提取試劑盒提取水稻植株的DNA；

步驟二：引物：檢測Pi25的引物對為CAP1F/R的引物序列，限制性內切酶為HincII；

步驟三：基因組DNA提取：用CTAB法提取水稻基因組DNA，1％的瓊脂糖凝膠檢測水稻基因組DNA；

步驟四：PCR擴增：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，73℃延伸30s，35個循環；73℃延伸3min；

步驟五：酶切：取15μL的利用CAP1引物PCR擴增產物，加入3μL酶切緩沖液，1.5μLHincⅡ限制性內切酶，補ddH₂O 5μL至20μL體系，37℃對產物酶切位點進行酶切；

步驟六：電泳完成后，用凝膠成像系統對電泳膠進行照相。

2.如權利要求1所述的水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法，其特征在于，所述步驟四中，PCR擴增體系為3μL DNA模板、0.7U Taq聚合酶、3μL 10×PCR緩沖液、2.0μLdNTPs(2.5mmol/L)、0.7μL正向引物(10μmol/L)和0.7μL反向引物(10μmol/L)，ddH₂O補足至20μL。

3.如權利要求2所述的水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法，其特征在于，所述步驟四中，所述PCR擴增采用PCR擴增儀對DNA片段進行擴增，在擴增過程中，采用GM(1，N)模型對PCR擴增儀的工作參數的數據進行建模，保持擴增過程工作參數控制的準確度，提高擴增質量；具體實施如下：

(1)構造PCR擴增儀的數據時間序列，建立原始數據序：

選取被校正PCR擴增儀的測得值作為系統特征行為變量而對應的檢測量設定為因子變量實驗溫度為因子變量濕度為因子變量

(2)進行數據處理，取X⁽⁰⁾為x⁽⁰⁾的1-AGO序列，即為一次累加序列：

其中，稱D為X⁽⁰⁾的一次累加生成算子；

(3)建立起行為與因子間的灰微分方程，PCR擴增儀的灰色GM(1，N)模型及對應的白化方程為：

式中：k＝1，2，3，…，n，a為模型的發展系數，反映預測數據x₁的發展態勢，b為灰作用量，反映數據間的變化關系；為PCR擴增儀的白化背景值，反映信息濃度的大小；

(4)通過對灰色模型在最小二乘法準則下的處理，可以得到：

且白化方程時間響應為：

式中：k＝2，3，…，n，B為GM(1，N)模型的系數矩陣，Y為行為變量矩陣；

(5)以上PCR擴增儀模型的建立以及運算，得到GM(1，N)模型在對應k處的預測值，其中通過累減生成算子可以得到：

(6)通過建立的GM(1，N)模型得到的在對應點處的預測值以及實際值比較，對PCR擴增儀采用的模型進行模型精度評價；

相對殘差：

殘差均值：

模型精度：

4.如權利要求1所述的水稻育種材料中抗稻瘟病基因Pi-25的檢測方法，其特征在于，所述步驟六中的電泳完成后，用凝膠成像系統對電泳膠進行照相；所述電泳，電泳儀內設有微型穩壓器；穩壓器中兩個運放，均采用負反饋電路，且帶隙電壓基準電路的輸出經過輸出放大器的跟隨結構直接輸出，因此穩壓器輸出電壓VOUT和偏移ΔVOUT：

其中R2/R3為帶隙電壓基準電路中的電阻比，V_EB1和V_EB2為NPN三極管Q1和Q2的發射極－基極電壓，ΔV_IN1|diff和ΔV_IN2|diff分別為兩級運放的輸出電壓偏移；

所述用凝膠成像系統對電泳膠進行照相，凝膠成像系統采用十字線灰度圖像清晰度計算的改進模型，十字線灰度圖像由mxn個像素構成，像素灰度值矩陣B(I，J)，其中0≤I≤m-1，0≤J≤n-1；

十字線灰度圖像最大灰度值B_max，最小灰度值B_min，那么灰度差值的1/2用B_dif表示為：

灰度圖像的清晰度為C，可得到十字線灰度圖像清晰度改進模型為：