[發(fā)明專利]一種靶向復(fù)合外泌體及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811338234.1
• 申請(qǐng)日: 2018-11-12
• 公開（公告）號(hào): CN109432434A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡春梅;唐秋莎;賈剛;安艷麗;黃莉莉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京市第二醫(yī)院（江蘇省傳染病醫(yī)院;南京市公共衛(wèi)生醫(yī)療中心）
• 主分類號(hào): A61K47/46
• 分類號(hào): A61K47/46;A61K47/18;A61K31/12;A61P35/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

本發(fā)明提供一種靶向復(fù)合外泌體及其制備方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括如下步驟：1)采用靶向多肽對(duì)外泌體進(jìn)行靶向修飾，得到膜修飾有靶向多肽的外泌體；2)將膜修飾有靶向多肽的外泌體、藥物、納米四氧化三鐵水溶液和電穿孔緩沖液混合，在2～6℃下進(jìn)行電穿孔處理后，在35～40℃下孵育25～35min，得到靶向復(fù)合外泌體。本發(fā)明制備得到的外泌體具有較高的主動(dòng)靶向能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靶向復(fù)合外泌體及其制備方法。

背景技術(shù)

外泌體是由細(xì)胞的質(zhì)膜經(jīng)兩次向內(nèi)凹陷形成多泡體，再與細(xì)胞內(nèi)膜融合，以胞吐的方式釋放出來的直徑在30-150nm的微囊泡。已被證明幾乎所有的人體細(xì)胞均可分泌不同性質(zhì)的外泌體，且廣泛分布于各種體液。外泌體作為載體可攜帶治療藥物或生物活性物質(zhì)到達(dá)病灶，發(fā)揮治療作用。外泌體作為藥物載體與傳統(tǒng)的人工納米載體相比，其優(yōu)勢(shì)在于：(1)免疫原性低，幾乎不會(huì)引起免疫反應(yīng)，更加安全；(2)體積很小，納米級(jí)別的粒徑，包載能力強(qiáng)，可以逃過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕捉，有效保護(hù)承載的藥物；(3)具有較強(qiáng)的組織滲透性和穿透生理屏障的能力，能穿過血腦屏障。通過與目標(biāo)細(xì)胞膜融合的方式，將藥物釋放到細(xì)胞質(zhì)中。(4)外泌體負(fù)載藥物后可以繞開P-糖蛋白，會(huì)顯著降低藥物進(jìn)入細(xì)胞后的外排作用。

外泌體作為載體雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但也有限制其應(yīng)用的不足之處，比如：外泌體缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞或炎細(xì)胞的主動(dòng)靶向能力，雖然納米級(jí)的載體可以利用異常細(xì)胞的高通透性和滯留效應(yīng)到達(dá)病灶部位，但是大多數(shù)載體需要通過主動(dòng)靶向來提高病灶部位的攝取。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種靶向復(fù)合外泌體及其制備方法，能夠提高外泌體的主動(dòng)靶向能力。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種載有藥物和納米材料的外泌體及其制備方法，包括如下步驟：

1)采用靶向多肽對(duì)外泌體進(jìn)行靶向修飾，得到膜修飾有靶向多肽的外泌體；

2)將所述步驟1)的膜修飾有靶向多肽的外泌體、藥物、納米四氧化三鐵水溶液和電穿孔緩沖液混合，在2～6℃下進(jìn)行電穿孔處理后，將得到的靶向復(fù)合外泌體初體在35～40℃下孵育25～35min，得到靶向復(fù)合外泌體。

優(yōu)選的，所述步驟1)中靶向修飾的方法包括以下步驟：

a、將PBS、NHS和4-戊炔酸混合后，調(diào)整pH至7.2～7.5，在2～6℃下震蕩50～70min，得到第一反應(yīng)體系；

所述PBS、NHS和4-戊炔酸的質(zhì)量體積比為1mL:35mg:29mg；

b、將所述步驟a的第一反應(yīng)體系與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽混合，在2～6℃下震蕩50～70min，得到第二反應(yīng)體系；所述第二反應(yīng)體系中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的終濃度為0.3mol/L；

c、將所述步驟b的第二反應(yīng)體系與含有外泌體的PBS溶液混合后，依次進(jìn)行震蕩、超濾，得到膜連接炔鍵的外泌體；

所述第二反應(yīng)體系與含有外泌體的PBS溶液的體積比為2：75；

d、在所述步驟c的膜連接炔鍵的外泌體中依次加入PBS溶液、無水硫酸銅溶液、L-抗壞血酸溶液、二水合紅菲繞啉溶液和含疊氮的多肽，在20～25℃充氮振蕩2.5～3.5h，得到膜修飾有靶向多肽的外泌體。

優(yōu)選的，所述步驟c中含有外泌體的PBS溶液中外泌體的質(zhì)量與PBS溶液的體積比為16μg:15μL。

優(yōu)選的，所述步驟c中震蕩的時(shí)間為22～26h，震蕩時(shí)的溫度為18～22℃。

優(yōu)選的，所述步驟c中超濾用膜的分子截留量為100KDa。