[發(fā)明專利]一種靶向復(fù)合外泌體及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811338234.1
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109432434A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡春梅;唐秋莎;賈剛;安艷麗;黃莉莉
• 申請（專利權(quán)）人: 南京市第二醫(yī)院（江蘇省傳染病醫(yī)院;南京市公共衛(wèi)生醫(yī)療中心）
• 主分類號: A61K47/46
• 分類號: A61K47/46;A61K47/18;A61K31/12;A61P35/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

1.一種靶向復(fù)合外泌體的制備方法，包括如下步驟：

1)采用靶向多肽對外泌體進行靶向修飾，得到膜修飾有靶向多肽的外泌體；

2)將所述步驟1)的膜修飾有靶向多肽的外泌體、藥物、納米四氧化三鐵水溶液和電穿孔緩沖液混合，在2～6℃下進行電穿孔處理后，將得到的靶向復(fù)合外泌體初體在35～40℃下孵育25～35min，得到靶向復(fù)合外泌體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中靶向修飾的方法包括以下步驟：

a、將PBS、NHS和4-戊炔酸混合后，調(diào)整pH至7.2～7.5，在2～6℃下震蕩50～70min，得到第一反應(yīng)體系；

所述PBS、NHS和4-戊炔酸的質(zhì)量體積比為1mL:35mg:29mg；

b、將所述步驟a的第一反應(yīng)體系與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽混合，在2～6℃下震蕩50～70min，得到第二反應(yīng)體系；所述第二反應(yīng)體系中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的終濃度為0.3mol/L；

c、將所述步驟b的第二反應(yīng)體系與含有外泌體的PBS溶液混合后，依次進行震蕩、超濾，得到膜連接炔鍵的外泌體；

所述第二反應(yīng)體系與含有外泌體的PBS溶液的體積比為2：75；

d、在所述步驟c的膜連接炔鍵的外泌體中依次加入PBS溶液、無水硫酸銅溶液、L-抗壞血酸溶液、二水合紅菲繞啉溶液和含疊氮的多肽，在20～25℃充氮振蕩2.5～3.5h，得到膜修飾有靶向多肽的外泌體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟c中含有外泌體的PBS溶液中外泌體的質(zhì)量與PBS溶液的體積比為16μg:15μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟c中震蕩的時間為22～26h，震蕩時的溫度為18～22℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟c中超濾用膜的截留分子量為100KDa。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟d中膜連接炔鍵的外泌體、PBS溶液、無水硫酸銅溶液、L-抗壞血酸溶液、二水合紅菲繞啉溶液和含疊氮的多肽的質(zhì)量體積比為160μg～65μg：300μL～310μL：14μL～15μL：71～75μL：32.8～35μL：0.2～2.1mg。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中膜修飾有靶向多肽的外泌體、藥物、納米四氧化三鐵水溶液和電穿孔緩沖液的質(zhì)量體積比為900～1100μg：2900～3100μg：90～110μg：1～1.1mL。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中電穿孔緩沖溶液為40～60mmol/L的海藻糖PBS溶液。

9.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中所述電穿孔處理的電壓為390～410v，所述電穿孔處理的電容為140～160μF，所述電穿孔處理的放電時間為0.9～1.1ms。

10.權(quán)利要求1～9任意一項方法制備得到的靶向復(fù)合外泌體。