[發明專利]瓢雞無尾基因及檢測瓢雞無尾性狀的方法、引物、試劑盒在審
【說明書】：
本發明屬于突變或遺傳工程；遺傳工程涉及的DNA或RNA，載體技術領域，公開了一種瓢雞無尾基因及檢測瓢雞無尾性狀的方法、引物、試劑盒，提供了瓢雞IRX1基因Mbo II和Ava II的2個檢測標記。本發明首次采用位置克隆技術，在全基因組關聯分析的基礎上，通過對相關區間內全部基因的序列測定和遺傳變異分析，揭示了IRX1基因為瓢雞無尾性狀的功能基因，建立了簡單、省時、低成本的快速有效PCR?RFLP檢測標記，為瓢雞無尾基因的純化及良種繁育體系的建立具有積極的指導意義。本發明的2個標記，可用于瓢雞無尾性狀的基因檢測與分子標記輔助育種，具有早期篩選、快速鑒定、節省時間、成本低廉、準確性高等特點。
技術領域
本發明屬于突變或遺傳工程；遺傳工程涉及的DNA或RNA，載體技術領域，尤其涉及一種瓢雞無尾基因及檢測瓢雞無尾性狀的方法、引物、試劑盒。
背景技術
目前，業內常用的現有技術是這樣的：瓢雞是中國“十一五”時期畜禽品種資源調查時發現中國特有珍稀雞種，其產區為云南省普洱市鎮沅縣，相鄰的寧洱縣、景東縣、景谷等縣也有小量分布。瓢雞因缺少尾部羽毛，包括尾羽和大小鐮羽，形似瓢狀，故稱作“瓢雞”，當地人也稱其為“團雞”。解剖發現，尾椎骨、尾棕骨、尾脂腺在瓢雞均不存在。與正常雞相比，瓢雞臀部豐滿圓潤，肉多骨少，繁殖速度快，肉質香甜細膩，適應性強，早熟等特點，屬于地方特色優質雞類型。據鎮沅縣縣志記載，1941年就有瓢雞被飼養。由于瓢雞尾羽和雞翹的不足，長期以來被認為不祥，所以種群數量一直較小。2006年畜禽遺傳資源調查時發覺僅存201只，瀕臨滅絕。瓢雞基本采用農戶散養，后經政府扶持和畜牧部門技術指導，建立瓢雞保種場，瓢雞種群數量逐年上升，2012年瓢雞存欄已達102024只。因其獨特的外貌特征和較高的經濟價值，瓢雞于2009年11月通過了國家家禽遺傳資源委員會鑒定，并與2014年列入“國家級家禽遺失資源保護名錄”且是云南省優先發展的6大名雞之一。到目前為止，瓢雞是國內首個發現和認定的無尾雞品種，國際上，也僅有起源于智利現飼養在美國的阿勞干雞(Araucana)有無尾性狀。阿勞干雞，源自于智利，現飼養在歐洲和美國等多個國度和地域，該雞種以其無尾、簇狀耳羽和藍殼蛋而著稱。阿勞干雞臀部成圓形、無明顯的尾部特征，由于沒有相應的尾椎骨、尾綜骨等骨骼支持，尾羽及尾脂腺也不復存在。外貌及剖解觀察發現，還存在一類介于無尾和有尾之間的中間類型，可能受修飾基因影響。克萊姆森大學Clark博士研究團隊2012年采用基因芯片全基因組關聯方法定位了阿勞干無尾性狀基因。該團隊采用60K雞基因組芯片，對40只無尾雞、11只有尾雞、7只中間類型雞進行了全基因組基因分型，將無尾基因定位在雞2號染色體88.77MB至89.51MB之間，該區間共有740kb，含有191個SNP，包括IRX1、IRX2兩個候選基因。無尾基因(Rp)基因全基因組關聯分析(GWAS)定位在雞2號染色體87.99～90.13Mb區間內，共有2.14MB，檢測到191個SNP；單倍型區間精細定位在88.78～89.51Mb區間，包括13個SNP，共有0.74MB。無尾基因Rp基因定位2號染色體的全基因關聯顯著Praw值為2.45×10-10，單個染色體的顯著Pgenome值為0.00575。IRX1和IRX2屬于易洛魁(Iroquois)基因家族，該基因家族包含有2個基因簇，1個為A簇，含有IRX1，IRX2和IRX4三個基因，1個為B簇，包含IRX3，IRX5和IRX6三個基因。IRX家族在脊椎動物胚胎發育的早期起重要的作用，主要影響中樞神經系統和骨骼發育系統。基因表達模式揭示，同一族成員在胚胎發育過程中協調表達，共同參與了機體發育的同化和特化，IRX2還參與了神經板的分化。在非洲爪蟾胚胎研究中，IRX1通過抑制Bmp4的表達調控神經區域和背側中胚層。IRX1和IRX2在果蠅和非洲爪蟾中已篩選出突變基因并鑒定了突變預模式。在基因功能研究方面，通過對小鼠和斑馬魚IRX基因敲除，發現IRX基因在其發育過程中具有抑制脊索和體節的形成，但對尾部發育影響不明顯。對無尾瓢雞和仙居雞的雛雞進行了解剖觀察，結果顯示瓢雞雛雞腰薦部椎骨數目與正常有尾雞相比明顯缺失，且該缺失變異在胚胎期形成，因此瓢雞可作為椎骨發育研究的重要模式動物。由于瓢雞資源發現較晚，數量和分布有限，目前對該雞的基礎研究相對較少。采用PCR產物直接測序技術對云南省鎮沅縣50只瓢雞樣品的線粒體DNA控制區(mtDNA D-loop)高變區序列進行了分析，共檢測到27個核苷酸多態位點，序列存在13種單倍型，表明瓢雞群體內遺傳變異較豐富，在遺傳組成上具有5個母系血統來源。對無尾瓢雞和仙居雞的雛雞進行了解剖觀察，結果顯示瓢雞雛雞腰薦部椎骨數目與正常有尾雞相比明顯缺失，且該缺失變異在胚胎期形成，因此瓢雞可作為椎骨發育研究的重要模式動物。對無尾瓢雞和仙居雞進行了雜交，對F2代雜交雞進行屠宰觀察，對尾部骨骼進行X光成像分析，結果顯示無尾性狀的基因為顯性及尾部形態結構。隨著全基因組測序的完成，大量動物基因組測序工作延續開展，雞基因組測序草圖與注釋也于2004年完成，使人們對雞基因組有了初步認識。雞基因組單倍體容量1.2×109DNA堿基對，有20000～23000個基因，分布在39對染色體上。2006年對該草圖做了修訂，補測了Z染色體及微小染色體的序列，填補了近800個基因組間隔(Gap)，注釋了更多的基因信息如基因的結構和功能等內容。目前正在進行第3版的修訂，預計不久將在NCBI公共信息平臺公布(Build 3.0)，為研究者提供更為精確和詳細的雞基因組信息。與雞基因組測序完成幾乎同步，研究人員通過3個家雞品種與紅色原雞序列的對比，構建了雞基因組的遺傳變異圖譜，發現雞基因組中含有280萬個SNPs。基于雞全基因組的遺傳變異，全基因組的SNP基因芯片得以開發。美國Illumina公司2011年首次推出雞60K SNP檢測芯片(60K Illumina SNP BeadChip)，該芯片共有57636個SNPs[60]。最近，Affymetrix公司又推出了雞600K分型芯片(600KHD)，可檢測SNPs的數量上升到580，954個，其中包括21，534個編碼區變異。據該公司介紹，600HD高密度芯片將成為第一個商業化的雞SNPs芯片，可用于基因組選擇(GS)，基因組關聯分析(GWAS)，選擇特征分析(selection signatureanalyses)，QTL精細作圖和拷貝數變異的檢測等研究。GWAS的試驗設計主要有兩類：一類是單階段設計(One-stage design)，另一類是兩階段設計(Two-stage design)。二者相比，兩階段是一種即經濟又高效的研究策略。基因分型有對個體DNA直接分型和混合DNA池檢測兩種策略。后者是將具有表型差異分組的個體DNA混合在一起構成不同DNA池，檢測兩個DNA池間的基因頻率差異，差異顯著并相互連鎖的標記被認為可能存在表型效應，該方法適于質量性狀或高低極端表型明顯的數量性狀分析。GWAS分析一般只是鑒定出和目標性狀相關的染色體片段，往往不是影響表型變異的主效基因或致因變異。因此，通過后續研究，如精細定位、位置克隆、表達譜分析、基因功能分析等，有利于揭示變異位點影響表型的作用機理，也可以直接應用于資源保護和育種工作。全基因組關聯研究(GWAS)使用高通量的基因分型技術在基因組范圍內搜索SNP，從整個基因組水平上檢測SNP以及整體分析關聯性，探討其與表型以及復雜性狀的關系，具有檢測速度快、結果更加可靠等優點，成為目前人們研究的熱點，在包括雞在內的許多家養動物的QTL定位和QTN鑒別方面已取得一系列研究成果。美國愛荷華州立大學動物科學系Abasht和lamont(2007)首次使用3000個SNPs對2個雞F2群體的腹脂率性狀進行了GWAS分析，發現39個SNPs位點[19]。隨后，在雞體重、生長、免疫、繁殖等性狀方面都陸續開展了全基因組關聯分析。美國海蘭蛋雞公司Wolc等(2014)運用42KIllumina SNP芯片對褐殼產蛋母雞連續8個世代13000只母雞進行全基因組GWAS分析，記錄的性狀包括產蛋量、11個蛋品質指標和初產母雞體重，采用Bayesian全基因組預測模型進行統計分析，結果顯示，在雞4號染色體78M處檢測到1個大效應QTL，該QTL可解釋32％的表型差異，另外，在雞17，12，和2號染色體也檢測到與產蛋量、蛋殼顏色及蛋白高度相關的QTL，表型差異解釋率在5-7％之間。對北京油雞和科寶肉雞構建的F2資源群體，對93日齡雞脛圍和脛長的全基因組關聯研究發現13號染色體上的NKX2-5基因可能影響脛長；4號染色體上LDB2、BOD1L1和QDPR等基因與脛圍顯著或潛在關聯。利用Illumina 60K SNP Beadchip對724只北京油雞的16個肉質性狀開展全基因組關聯分析，發現在4號染色體上存在7個顯著SNPs，4個候選基因(LCORL，LAP3，LDB2，TAPT1)與胴體重和內臟重量相關，此外還預測了GJA1基因可能影響油雞的胸肌發育。(2012)對雞馬立克病(Marek’s disease，MD)采用病例對照的方法進行了全基因組關聯研究，在全基因組顯著水平和極顯著水平上分別檢測到1個SNP，基因注釋結果表明這兩個位點分別落在SMOC1和PTPN3基因內。與對照組相比，SMOC1基因在病例組的脾臟中顯著上調差異表達，由此推測該基因在MD中發揮重要作用。采用個體基因分型與DNA混合池分型相結合的GWAS分析是今后鑒定疾病和經濟性狀基因的一個重要趨勢，該技術在不損失檢測效應的同時可大大降低檢測費用。(2013)對美國Virginia雞生長性狀雙向選擇50代以上的體重大和體重小的兩個類群開展GWAS及生物信息學分析，結合個體與DNA混合池的60K SNP芯片分型技術，成功鑒定了10個與生長性狀相關的主效基因(GCG，IGFBP2，GRB14，CRIM1，FGF16，VEGFR-2，ALG11，EDN1，SNX6，BIRC)。在雞體型外貌等質量性狀的基因定位和篩選方面，GWAS也大大提高了檢測效率。(2012)通過連鎖分析和全基因組關聯研究發現雞鳳頭性狀的QTL位于E22C19W28連鎖群上，且HOXC基因簇與其關聯。通過對26個不同品種的鳳頭雞和非鳳頭雞的組織表達分析發現HOXC8在胚胎發育期顏骨皮膚中異位表達，由此推斷鳳頭的產生是由H0XC8異位表達的順式作用元件突變引起的。(2012)通過GWAS鑒定阿勞干雞(Araucan chicken)無尾羽和耳絨毛性狀的候選基因。其中雞2號染色體2.14Mb的單倍型中兩個易洛魁族(Iroquois)同源盒基因(homeobox genes)，IRXl和IRX2基因，在無尾羽阿勞干雞具有一致的單倍型。具有耳絨毛性狀的雞共有一個0.58Mb的單倍型，包含7個基因，其中TBX1和GNB1L可能是該性狀的重要候選基因。此外，GWAS分析已定位多個質量性狀，如雞的多趾、羽色、黑色素沉積、鳳頭等性狀相關基因或QTL都已成功定位。值得一提的是，雞600K Affymetrix Axiom HD genotyping array芯片開始用于GWAS分析，并已顯示高分辨率優越性。最近，(2014)用600K SNP芯片定位id基因，在Z染色體78.5to79.2Mb區間內發現3個SNP與id基因緊密連鎖。可以預見，600K Affymetrix Axiom HD高密度SNP芯片將在雞基因組分析領域應用越來越廣泛。瓢雞是中國畜禽品種資源特有珍稀雞種,其產區為云南省普洱市鎮沅縣，相鄰的寧洱縣、景東縣、景谷等縣也有小量分布。到目前為止，瓢雞是國內首個發現和認定的無尾雞品種。瓢雞因缺少尾部羽毛，包括尾羽和大小鐮羽，形似瓢狀，故稱作“瓢雞”，當地人也稱其為“團雞”。解剖發現，尾椎骨、尾棕骨、尾脂腺在瓢雞均不存在。與正常雞相比，瓢雞臀部豐滿圓潤，肉多骨少，繁殖速度快，肉質香甜細膩，適應性強，早熟等特點，屬于地方特色優質雞類型。由于瓢雞尾羽和雞翹的缺失，長期以來被認為不祥，所以種群數量一直較小。2006年畜禽遺傳資源調查時發覺僅存201只，瀕臨滅絕。瓢雞于2009年11月通過了國家家禽遺傳資源委員會鑒定，并與2014年列入“國家級家禽遺失資源保護名錄”且是云南省優先發展的6大名雞之一。目前對該雞的基礎研究相對較少。貢潘偏抽等(2011)采用PCR產物直接測序技術對云南省鎮沅縣50只瓢雞樣品的線粒體DNA控制區(mtDNA D-loop)高變區序列進行了分析，共檢測到27個核苷酸多態位點，序列存在13種單倍型，表明瓢雞群體內遺傳變異較豐富，在遺傳組成上具有5個母系血統來源。對無尾瓢雞和仙居雞的雛雞進行了解剖觀察，結果顯示瓢雞雛雞腰薦部椎骨數目與正常有尾雞相比明顯缺失，且該缺失變異在胚胎期形成，因此瓢雞可作為椎骨發育研究的重要模式動物。對無尾瓢雞和仙居雞進行了雜交，對F2代雜交雞進行屠宰觀察，對尾部骨骼進行X光成像分析，結果顯示無尾性狀的基因為顯性及尾部形態結構。在瓢雞羽色與膚色等色素性狀研究方面，分析了黑色素受體(MC1R)基因、酪氨酸酶(TYR)基因與可溶性載質轉運蛋白(SLC24A5)3個基因在瓢雞不同羽色和膚色類群間的遺傳差異，建立了MC1R基因TaqI、TYR基因HindIII和SLC24A5基因NheI 3個PCR-RFLP標記。在生長發育、屠宰性能和體尺測定方面，研究了類胰島素生長因子受體1(IGFI)基因和線粒體DNA氧化酶基因(COX3)與上述性狀的相關性。瓢雞IGF1基因相對保守，沒有檢測到瓢雞IGF1基因變異位點。在瓢雞線粒體COX3基因檢測到C10669T多態位點，建立了EcoRV PCR-RFLP分子標記，利用該標記對300日齡具有生長和屠宰性狀記錄的82只瓢雞個體進行了基因分型，發現瓢雞EcoRVPCR-RFLP標記與體重、龍骨長、屠體重與胸肌率4個性狀相關顯著。在瓢雞疾病抵抗力方面，分離到瓢雞特有腸炎沙門氏菌菌株，鑒定了雞白痢易感群體和抗性群體，分析了殺菌蛋白基因(BPI)多態性與瓢雞12項血液生理指標的相關分析，研究表明，瓢雞BPI基因存在高度變異，在所測定的BPI基因3200bp序列中共檢測到18個SNP位點，有4個SNP位點在沙門氏菌抗性群體和易感群體間基因頻率存在顯著差異。國際上，也僅有起源于智利現飼養在美國的阿勞干雞(Araucana)有無尾性狀，該雞種以其無尾、簇狀耳羽和藍殼蛋而著稱。阿勞干雞臀部成圓形、無明顯的尾部特征，由于沒有相應的尾椎骨、尾綜骨等骨骼支持，尾羽及尾脂腺也不復存在。外貌及剖解觀察發現，還存在一類介于無尾和有尾之間的中間類型，可能受修飾基因影響。2012年采用基因芯片全基因組關聯方法定位了阿勞干無尾性狀基因。該團隊采用60K雞基因組芯片，對40只阿勞干無尾雞、11只有尾雞、7只中間類型雞進行了全基因組基因分型，無尾基因(Rp)基因全基因組關聯分析(GWAS)定位在雞2號染色體87.991～90.13Mb區間內，共有2.14MB，檢測到191個SNP；單倍型區間精細定位在88.78～89.51Mb區間，包括13個SNP,共有0.74MB。無尾基因Rp基因定位2號染色體的全基因關聯顯著Praw值為2.45×10-10，單個染色體的顯著Pgenome值為0.00575。
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