[發明專利]一種仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制備方法

有效

• 申請號: 201811332705.8
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109248157B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 王瑩
• 申請（專利權）人: 臨沂大學
• 主分類號: A61K9/50
• 分類號: A61K9/50;A61K47/24;A61K47/42
• 代理公司: 北京棧橋知識產權代理事務所(普通合伙) 11670
• 代理人: 劉亞娟

本發明公開了一種仿生嵌入固定化酶?改性磷脂微囊的制備方法，包括以下步驟：(1)改性磷脂的制備；(2)改性磷脂微粒的制備；(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒；(4)酶?改性磷脂微囊的分離。本發明通過電磁?超聲耦合處理對磷脂進行改性，可改變其空間結構，有利于酶蛋白的嵌入，并且能提高嵌合的穩定性，利用培養基質液及制造脈沖生物電，模擬仿生環境，提高酶活力，從而提高酶蛋白嵌入成功率。利用本發明的方法制備的酶?改性磷脂微囊作為藥物載體，相較于普通納米脂質載體，藥物的溶解度可提高1.9?2.1倍。

技術領域

本發明涉及膜酶活性科研實驗研究技術領域，具體涉及一種仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制備方法。

背景技術

生物膜的組分繁多，分離純化的難度較大，因此早年為便于研究，往往采用單一或幾種脂質組成的各種人工膜結構：單分子層膜、累積膜、脂質體、平板雙分子層脂膜等，同時，生物膜上還有大量的酶結合位點，也可將蛋白質嵌入后組成重建膜，這些膜結構泛稱“人工膜”。

1965年，英國學者Bangham A D把磷脂分散到過量水中，形成了一種由雙分子膜組成的閉合磷脂微囊，這一發現開創了新的研究領域。人工磷脂微囊具有類似于生物膜的結構，構成雙分子層的類脂親水性的頭部形成膜的內表面，而親脂性的尾部則處于膜的中間，這種類膜結構使其能夠包裹多種物質。因此，近些年利用脂質體可以和細胞膜融合等特點制備脂質體載體藥物是人工膜的另一項比較大的拓展。

為了解決溶解性差藥物的低口服生物可利用率的問題，利用磷脂或卵磷脂等脂質體形成的生物膜制備的藥物載體，通過將難溶藥物進行包裹，提高藥物溶解度，進而提高藥物的利用率。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：以往的人工磷脂微囊形成方法不同，所形成的磷脂微囊與酶蛋白的嵌合率低，影響其作為藥物載體的成效，使得口服藥物生物利用率降低。從而提供一種仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制備方法。

本發明的技術方案為：一種仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)改性磷脂的制備

S1：將磷脂溶解于去離子水中，配制成為濃度為3-5％的磷脂溶液；

S2：將所述磷脂溶液在惰性氣體氛圍保護下進行電磁-超聲耦合處理，得到改性磷脂溶液；

(2)改性磷脂微粒的制備

S1：向所述改性磷脂溶液中加入脫氧膽酸鈉至終濃度為3％，水浴控溫至25-26℃；

S2：在惰性氣體氛圍保護下進行超聲波震蕩分散，時間為10-20min，溫度控制在4-10℃；

S3：真空冷凍干燥后得到改性磷脂微粒；

(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒

S1：取濃度為3-5mg/ml的酶蛋白溶液在1.5-3.5kv/cm范圍內，經工頻電場處理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速勻漿機勻漿處理2-3次；

S2：將改性磷脂微粒利用等體積比的磷酸緩沖液復溶，復溶液體再與2-3倍體積比的培養基質液混合，調節pH至6.8-7.3；

S3：加入處理過的酶蛋白溶液，使得酶蛋白與磷脂的質量比為1:50-60；

S4：30℃恒溫孵育40-60min，期間利用石墨電極制造脈沖生物電，模擬仿生環境，并且分3次補充葡萄糖，葡萄糖添加總量為25mg/L；

(4)酶-改性磷脂微囊的分離

S1：離心，棄上清，用10mM磷酸緩沖液對酶-改性磷脂微囊充分洗滌，再將酶-改性磷脂微囊重懸于100倍體積的10mM磷酸緩沖液中；