[發明專利]一種仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制備方法

有效

• 申請號: 201811332705.8
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109248157B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 王瑩
• 申請（專利權）人: 臨沂大學
• 主分類號: A61K9/50
• 分類號: A61K9/50;A61K47/24;A61K47/42
• 代理公司: 北京棧橋知識產權代理事務所(普通合伙) 11670
• 代理人: 劉亞娟

1.一種仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)改性磷脂的制備

S1：將磷脂溶解于去離子水中，配制成為濃度為3-5％的磷脂溶液；

S2：將所述磷脂溶液在惰性氣體氛圍保護下進行電磁-超聲耦合處理，得到改性磷脂溶液；所述電磁-超聲耦合處理的方法為：電磁場處理的強度為2500-4000高斯，壓力為0.1-0.2bar，超聲波頻率為30KHz，處理溫度為25℃，處理時間為8-10min；

(2)改性磷脂微粒的制備

S1：向所述改性磷脂溶液中加入脫氧膽酸鈉至終濃度為3％，水浴控溫至25-26℃；

S2：在惰性氣體氛圍保護下進行超聲波震蕩分散，時間為10-20min，溫度控制在4-10℃；所述超聲波震蕩分散的具體操作為：采用超聲波橫波斜探頭，將探頭伸入液下1cm，并與液面呈45度夾角，頻率為25KHz，脈沖時間為10s；

S3：真空冷凍干燥后得到改性磷脂微粒；

(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒

S1：取濃度為3-5mg/ml的酶蛋白溶液在1.5-3.5kv/cm范圍內，經工頻電場處理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速勻漿機勻漿處理2-3次；

S2：將改性磷脂微粒利用等體積比的磷酸緩沖液復溶，復溶液體再與2-3倍體積比的培養基質液混合，調節pH至6.8-7.3；所述培養基質液包括：1.8-2.2wt％磷酸二羥基丙酮、0.5-0.7wt％脫氧膽酸鈉、2.1-2.4wt％海藻糖、1.1-1.4wt％半胱氨酸，余量為30mM磷酸緩沖液；

S3：加入處理過的酶蛋白溶液，使得酶蛋白與磷脂的質量比為1:50-60；

S4：30℃恒溫孵育40-60min，期間利用石墨電極制造脈沖生物電，模擬仿生環境，并且分3次補充葡萄糖，葡萄糖添加總量為25mg/L；所述石墨電極制造脈沖生物電的具體操作為：所述的脈沖頻率為400Hz，脈沖強度為1-6mv/cm，每間隔5min脈沖處理100-500μs；所述葡萄糖的添加方法為：第一次12mg/L，第二次8mg/L，第三次5mg/L，每次間隔10min；

(4)酶-改性磷脂微囊的分離

S1：離心，棄上清，用10mM磷酸緩沖液對酶-改性磷脂微囊充分洗滌，再將酶-改性磷脂微囊重懸于100倍體積的10mM磷酸緩沖液中；

S2：裝入密封超濾膜，通入惰性氣體，正壓過濾16-24h；所述正壓過濾的壓力為3-8bar；惰性氣體為氮氣或者氬氣；

S3：真空冷凍干燥得到酶-改性磷脂微囊固體粉末。