[發明專利]一種表達制備UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的方法

有效

• 申請號: 201811331222.6
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109402152B
• 公開（公告）日: 2021-08-13
• 發明（設計）人: 李拖平;李蘇紅;孫玥;佟超男
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N15/75;C12N1/21;C12N9/90;C12R1/125
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 胡洋

本發明涉及一種高效表達制備UDP?葡萄糖?4?差向異構酶的方法，是將UDP?葡萄糖?4?差向異構酶(GalE)基因與枯草芽孢桿菌用載體構建重組表達載體。然后將重組表達載體轉化至枯草芽孢桿菌中構建重組工程菌。將重組工程菌在液體培養基中誘導培養，菌液離心，取上清液。本發明的方法UDP?葡萄糖?4?差向異構酶產量高，蛋白較純凈，回收純化容易，生產操作簡單，為GalE的工業化大規模生產提供了便利，提高了產量，省時省力，節約成本。尤其是對該酶在食品工業中的應用提供了安全保障，具有重大意義。

技術領域

本發明涉及一種能高效表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的重組工程菌以及用改進高效表達制備UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

UDP-葡萄糖-4-差向異構酶(UDP-glucose 4-epimerase,GalE)，是參與到生物體內半乳糖代謝的一個關鍵酶，和半乳糖激酶(galactokinase)，1-磷酸半乳糖尿苷酰轉移酶(galac-tose-1-p-uridylyltransferase)共同參與到半乳糖代謝，這一過程稱為Leloir途徑。UDP-葡萄糖4-差向異構酶催化半乳糖代謝是Leloir的最后一步，也是關鍵的一步，通過UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖之間的轉化，耦聯糖酵解和TCA循環而完成代謝過程。此外，枯草芽孢桿菌被認為是動物腸道內的益生菌，安全性高，可應用于食品、藥品等工業中，具有非致病性；外源DNA獲取方便，不僅質粒可作為異源基因的克隆載體，噬菌體也可以應用于此，具有較強的遺傳特性；蛋白的分泌系統較為完善，分泌的外源蛋白可跨過細胞膜直接釋放到細胞外，具有較強的蛋白分泌能力，從而簡化蛋白的回收和純化過程，適用于工業化生產；在較為簡單的培養基中培養，就能達到很高的菌密度，適用于工業化生產。然而現有技術中，UDP-葡萄糖4-差向異構酶在野生菌中提取時的產率很低，分離精制困難，不適合大批量的制備。有通過大腸桿菌表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的，但在大腸桿菌中是胞內表達，易形成包涵體，同時，酶蛋白的獲取需要對細胞進行破碎處理，雜蛋白含量高，分離精制困難，操作繁瑣耗時，蛋白表達量也不高。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明的目的之一是采用基因工程技術構建一種高效表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的重組表達載體及重組工程菌。

本發明的目的之二是提供一種產量高，蛋白較純凈，回收純化容易，生產操作簡單的利用重組工程菌生產UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的方法。

本發明采用的技術方案是：一種高效表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的重組表達載體，所述的重組表達載體是將UDP-葡萄糖-4-差向異構酶(GalE)基因與表達載體連接，構建的重組表達載體；所述的表達載體是枯草芽孢桿菌用載體或大腸桿菌-枯草芽孢桿菌用穿梭載體。

進一步的，上述的高效表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的重組表達載體，所述的表達載體是pHT系列載體、穿梭載體pMA5或穿梭載體pWB980等。但不限于這些載體，所有枯草芽孢桿菌用載體或大腸桿菌-枯草芽孢桿菌用穿梭載體均可使用。

更進一步的，上述的高效表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的重組表達載體，所述的pHT系列載體是pHT43、pHT304或pHT01載體。

進一步的，上述的高效表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的重組表達載體，所述的表達載體中含有或不含有蛋白純化標簽。

更進一步的，上述的高效表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的重組表達載體，所述的蛋白純化標簽是組氨酸(His-tag)標簽。

一種高效表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的重組工程菌，是將上述的高效表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的重組表達載體轉化至宿主菌中構建的重組工程菌；所述的宿主菌是枯草芽孢桿菌。

進一步的，上述的一種高效表達UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的重組工程菌，所述的轉化為電轉化。