[發明專利]一種混菌發酵轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體的方法

有效

• 申請號: 201811330942.0
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109536562B
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發明（設計）人: 王敏;申雁冰;楊妍;駱健美;夏夢雷;王喜波
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P33/02;C12R1/32;C12R1/66
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于甾醇生物轉化技術領域，具體涉及一種混菌發酵生物轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體11α?羥基?雄甾?4?烯?3,17?二酮的方法。本發明將分枝桿菌TCCC 11028 M3接入含有植物甾醇和轉化介質環糊精的發酵培養基中，培養24h后接種赭曲霉CICC 41473孢子液繼續進行轉化。本發明利用混菌發酵實現了由植物甾醇到11α?羥基?雄甾?4?烯?3,17?二酮的一步轉化。此方法提高了產物的生成率，縮短了轉化周期，簡化操作，節約成本，適用于甾體化合物生物轉化的生產。

技術領域：

本發明屬于甾醇生物轉化技術領域，具體涉及一種混菌發酵生物轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法。

背景技術：

甾體化合物是含有四個環戊烷多氫菲的萜類化合物，廣泛存在于動植物組織和一些微生物細胞中。以甾體化合物為原料生產的甾體藥物對機體起著非常重要的調節作用，其被廣泛地用于疾病治療和健康保健。目前，甾體藥物的市場需求僅次于抗生素，如醛固酮拮抗劑、依普利酮已臨床治療心衰、高血壓、水腫、肝腹水、呼吸衰竭等多種疾病。11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮(11α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione，11α-OH AD)是哺乳動物中主要的腎上腺甾體，并且是合成鹵化皮質激素(天然皮質類固醇有藥學價值的類似物)的關鍵前體。已經發現多種微生物可以利用雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)羥基化為11α-OH AD，主要為一些真菌菌種包括赭曲霉、雅致小克銀漢霉、黑根霉、球孢白僵菌、金龜子綠僵菌等。

長期以來，甾體化合物生產中主要原材料是天然薯蕷皂素。然而，將天然薯蕷皂素通過化學方法轉化為有價值的甾體有很多缺點，比如成本高，步驟復雜，產量低，土地資源及野生植物資源浪費等。近年來，甾體生產主要集中于對天然薯蕷皂素的替代物植物甾醇(谷甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇，菜油甾醇)的微生物轉化。來自農業，食品，纖維素制造業的廢棄物植物甾醇不需純化直接可以用于生產有價值的甾體化合物。分枝桿菌、紅球菌、米曲霉、串珠鐮刀菌等可以轉化植物甾醇生產AD，其中分枝桿菌屬及紅球菌屬是最有效生產AD的微生物。

在工業生產中，以植物甾醇為原料生產11α-OH AD需要經過兩步微生物轉化反應。第一步，分枝桿菌側鏈降解植物甾醇生成AD；第二步，利用具有11α羥化能力的菌株將AD羥基化得到11α-OH AD。在實際操作中，如對每步反應的產物進行提取、分離就造成大量的人力、物力和時間的浪費。如果把上述提及的兩步微生物轉化反應一步完成，會使整個工藝過程簡化，同時節約了大量用于提取、分離操作的有機溶劑，降低了生產成本。而混菌發酵在技術上也存在一定的難度，主要是由于不同菌種的生長和發酵條件存在很大差異，如溫度、培養基、pH等方面很難在同一發酵條件下使得兩種菌各自發揮最大的酶活力。因此，尋找一組合適的微生物組合及發酵方法能夠實現從植物甾醇到11α-OH AD的一步轉化十分重要。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種縮短發酵周期、節約成本并且提高產物生成率的混菌發酵轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法。

本發明采用的生產菌株為赭曲霉(Aspergillus ochraceus)和分枝桿菌(Mycobacterium neoaurum)。

應用上述微生物轉化植物甾醇生產11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其步驟如下：

(1)在含有2-30g/L的植物甾醇的發酵培養基中，按3-14％接種量接入分枝桿菌種子培養液，25℃-32℃，150-220r/min，培養24h；

(2)將赭曲霉孢子懸浮液以孢子終濃度為0.5-2×10⁶個/mL的接種量接入步驟(1)獲得的培養液中，培養溫度為25℃-32℃，150-220r/min的轉速下轉化4-7d；

優選地，當植物甾醇濃度為2-7g/L時，轉化4-5d，產物生成率達到79-87.3％；