[發明專利]一種混菌發酵轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體的方法

有效

• 申請號: 201811330942.0
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109536562B
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發明（設計）人: 王敏;申雁冰;楊妍;駱健美;夏夢雷;王喜波
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P33/02;C12R1/32;C12R1/66
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

1.一種混菌發酵轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，步驟如下：

（1）在含有2-30 g/L的植物甾醇的發酵培養基中，按3-14%接種量接入分枝桿菌種子培養液，25℃-32℃，150-220 r/min，培養24 h；

（2）將赭曲霉孢子懸浮液以孢子終濃度為0.5×10⁶-2×10⁶個/mL的接種量接入步驟（1）獲得的培養液中，培養溫度為25℃-32℃，150-220 r/min的轉速下轉化4-7d；

所述赭曲霉為赭曲霉（A.ochraceus）CICC 41473；

所述分枝桿菌為分枝桿菌（Mycobacterium neoaurum）TCCC 11028 M3（MNR M3）；

所述發酵培養基組成為：葡萄糖 25-45 g/L，檸檬酸 2-10 g/L，檸檬酸鐵銨 0.05-0.5g/L，硫酸鎂 0.5-2 g/L，磷酸氫二鉀 0.5-2 g/L，磷酸氫二銨 3.5-10 g/L，玉米漿 30-60g/L，蠶蛹粉 2-10 g/L，環糊精10-100 g/L，其余為水，pH 6.5-7.0。

2.如權利要求1所述的一種混菌發酵轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，所述分枝桿菌種子培養液的培養方法如下：使用0.5%的Tween 80無菌水溶液洗下斜面種子，使菌體OD₆₀₀值控制在1.0±0.2，以3-15%的接種量接種到種子培養基中，28℃，200 r/min，36-48 h培養至對數生長期。

3.如權利要求2所述的一種混菌發酵轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，所述種子培養基組成為: 磷酸氫二鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，檸檬酸鐵銨0.05 g/L，檸檬酸2 g/L，硝酸銨 2 g/L，丙三醇 20 g/L，葡萄糖10 g/L，碳酸鈣 10 g/L，其余為水，pH自然，115 ℃高壓蒸汽下滅菌20 min。

4.如權利要求1所述的一種混菌發酵轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，所述赭曲霉孢子懸浮液的制備方法如下：采用無菌水將斜面上的菌體洗下，并將含孢子的懸浮液倒入滅過菌的上面附有3層紗布并盛有玻璃珠的三角瓶中，進行充分震蕩，配成一定濃度的孢子懸浮液。

5.如權利要求1所述的一種混菌發酵轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，植物甾醇濃度為2-7g/L時，轉化時間為4-5d。

6.如權利要求1所述的一種混菌發酵轉化植物甾醇制備甾體藥物中間體11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，步驟如下：

（1）在含有3 g/L的植物甾醇的發酵培養基中，按8%接種量接入分枝桿菌種子培養液，28℃，200 r/min，培養24 h；

（2）將赭曲霉孢子懸浮液以孢子終濃度為10⁶個/mL的接種量接入步驟（1）獲得的培養液中，培養溫度為28℃，200 r/min的轉速下轉化5d；

所述的發酵培養基的組成為: 葡萄糖 30 g/L，檸檬酸2 g/L，檸檬酸鐵銨0.05 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸氫二銨3.5 g/L，玉米漿 40 g/L，蠶蛹粉 2 g/L ，環糊精 38 g/L，其余為水，pH 6.5-7.0，121 ℃高壓蒸汽下滅菌20 min。