[發(fā)明專利]一種線粒體定位導(dǎo)肽及其發(fā)現(xiàn)方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811330295.3
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109575116B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏立群;魯義善;汪志文;陳建林
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東海洋大學(xué);廣東海洋大學(xué)深圳研究院
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K19/00;C12N15/12;C12N15/62;C12N15/85;G01N33/68;A61K47/42;A61P35/00;A61P7/00;A61P31/12;A61P33/00;A61P31/04
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11562
• 代理人: 宋平

本發(fā)明公開了一種線粒體定位導(dǎo)肽及其編碼序列和應(yīng)用。本發(fā)明提供的線粒體定位信號肽，為如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有線粒體定位導(dǎo)肽功能的由序列1衍生的多肽。本發(fā)明提供了一種線粒體定位導(dǎo)肽及其編碼序列。本發(fā)明提供的線粒體定位導(dǎo)肽可將目標(biāo)蛋白靶向定位于真核細(xì)胞線粒體上。將本發(fā)明提供的線粒體定位導(dǎo)肽和適宜的目標(biāo)蛋白形成融合蛋白，可以得到用于治療遺傳病、惡性腫瘤、血液病，病毒、寄生蟲、細(xì)菌感染等疾病的疫苗和藥物，并實現(xiàn)高效定向給藥。本發(fā)明對于生物技術(shù)領(lǐng)域和醫(yī)藥領(lǐng)域具有重大價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及線粒體定位導(dǎo)肽及其發(fā)現(xiàn)方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

真核生物與原核生物最大的區(qū)別是真核生物的細(xì)胞發(fā)展出了復(fù)雜的細(xì)胞器體系。細(xì)胞器是細(xì)胞中通過生物膜與細(xì)胞中其他部分分隔開來的、功能上獨立的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。細(xì)胞器可按各自擁有膜的層數(shù)大致分為三類：雙層膜內(nèi)共生體細(xì)胞器主要包括線粒體、細(xì)胞核、葉綠體等；單層膜細(xì)胞器主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、液泡、溶酶體及過氧化物酶體等；無膜細(xì)胞器主要包括核糖體、中心體及穹窿體等。這些細(xì)胞器組成了細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)，使真核細(xì)胞能正常的工作、運轉(zhuǎn)。

線粒體(mitochondrion)是一種存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的由兩層膜包被的細(xì)胞器，是細(xì)胞中制造能量的細(xì)胞器，也是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場所，其直徑在0.5到1.0微米左右。大多數(shù)真核細(xì)胞或多或少都擁有線粒體，但它們各自擁有的線粒體在大小、數(shù)量及外觀等方面上都有所不同，如肝臟細(xì)胞中有1000-2000個線粒體。線粒體擁有自身的遺傳物質(zhì)和遺傳體系，但其基因組大小有限，是一種半自主細(xì)胞器，線粒體基因組屬于母系遺傳。除了為細(xì)胞供能外，線粒體還參與諸如細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程，并擁有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的能力。線粒體與許多疾病相關(guān)，比如母系遺傳Leigh綜合征、線粒體肌病、Leer遺傳性視神經(jīng)病等線粒體病，這是一大類的遺傳代謝病，其致病的原因主要由核基因和線粒體基因造成，臨床表現(xiàn)復(fù)雜[1,2]。研究還發(fā)現(xiàn)線粒體功能改變能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[3]。

導(dǎo)肽又稱轉(zhuǎn)運肽(transit peptide)或?qū)蛐蛄?targeting sequence)，它是游離核糖體上合成的蛋白質(zhì)的N-端信號。在蛋白質(zhì)運送過程中發(fā)揮重要作用，一般引導(dǎo)蛋白進(jìn)入線粒體或葉綠體[4]。導(dǎo)肽是新生蛋白N-端一段大約20～80個氨基酸的肽鏈，通常是疏水的，由非電負(fù)性氨基酸構(gòu)成，中間夾有堿性氨基酸，而沒有酸性氨基酸，羥基氨基酸含量高，易形成雙親α螺旋輪(amphiphilic helix)。不同的導(dǎo)肽序列缺乏同源性，這意味著和識別有關(guān)的信號不是一級結(jié)構(gòu)，而是二級、三級結(jié)構(gòu)，或這一區(qū)域產(chǎn)生的特點。有一種可能是導(dǎo)肽形成一種雙親α螺旋，即帶電荷的基團在螺旋的一側(cè)，不帶電荷的在另一側(cè)。進(jìn)入線粒體或葉綠體的蛋白是要通過翻譯后加工，初始合成的前體要比成熟的蛋白長12-20aa，而導(dǎo)肽負(fù)責(zé)細(xì)胞器外膜的初始識別、起始前體蛋白和細(xì)胞器膜的相互作用。導(dǎo)肽存在著獨立折疊的結(jié)構(gòu)域，能折疊成一個適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)供細(xì)胞器表面受體識別[5]。導(dǎo)肽穿越過膜后被細(xì)胞器的蛋白酶切下、轉(zhuǎn)運繼續(xù)進(jìn)行、直至整個的蛋白都穿越過膜，或直到中部的序列導(dǎo)致轉(zhuǎn)運的停止。導(dǎo)肽含有作為細(xì)胞器蛋白定位所需的所有信息。導(dǎo)肽的這種能力可以通過構(gòu)建人工蛋白來檢驗。將來自細(xì)胞器的導(dǎo)肽和位于胞液中的蛋白連接起來。具體方法是構(gòu)建融合基因，然后翻譯成融合蛋白。線粒體定位導(dǎo)肽通過這種實驗，可以表現(xiàn)出具有獨立引導(dǎo)附著順序進(jìn)入線粒體靶位點的功能。

研究蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運和亞細(xì)胞定位具有很大的應(yīng)用價值，因為蛋白質(zhì)的功能通常和其亞細(xì)胞定位息息相關(guān)，比如病原的分泌蛋白往往是重要的毒力因子，與其致病性緊密相關(guān)。此外，信號肽和導(dǎo)肽在藥物靶向運送及疾病治療中也具有廣泛的應(yīng)用，比如可以利用核定位信號，可以將治療基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，從而進(jìn)行疾病的細(xì)胞定向基因治療。由于線粒體與多種疾病有關(guān)，特別是一些由于線粒體基因突變而引起的疾病，線粒體定位的導(dǎo)肽能夠?qū)⒅委熁虬卸ㄎ坏骄€粒體上、進(jìn)行線粒體定向基因治療，為基因治療提供一個好的前景。研究線粒體定位導(dǎo)肽，不僅可以揭示線粒體定位蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能和機制，同時還能為特異的線粒體靶向生物技術(shù)藥物開發(fā)提供技術(shù)支持。