[發(fā)明專利]一種具有農(nóng)藥降解活性的植物乳桿菌、其制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811329631.2
• 申請(qǐng)日: 2018-11-09
• 公開（公告）號(hào): CN109266587A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張和平;陳永福;李常坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A01N63/00;A01N63/02;A01P3/00;A61K35/747;A61P1/00;A61P39/02;A23L29/00;A23L33/135;A23L5/20;C11D7/40;C11D7/60;C12R1/25
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11305
• 代理人: 黃綠雯

1.一株具有農(nóng)藥降解活性的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)P9，該菌株已于2018年8月30日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCCNo.16401。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌P9，其特征在于所述農(nóng)藥包括氧化樂果、甲拌磷和樂果。

3.權(quán)利要求1的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)P9的制備方法，其特征在于該方法包括下述步驟：

A、菌株活化培養(yǎng)

取酸粥樣品，將所述酸粥樣品按照10^-4、10^-5、10^-6梯度稀釋后涂布于含有0.1wt％放線菌酮和0.1wt％硫酸粘菌素的MRS培養(yǎng)基平板或者M(jìn)17培養(yǎng)基平板上，30℃厭氧培養(yǎng)48h～72h，然后挑取單菌落轉(zhuǎn)接于TPY增菌培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)24h～48h，再劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h～48h，觀察記錄菌落形態(tài)和革蘭氏染色細(xì)胞形態(tài)特征，并進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)；挑選革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性的菌株作為待試菌株，分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h～48h后，做進(jìn)一步鑒定；

B、分子生物學(xué)鑒定

取步驟A的待試菌株分別接種于TPY增菌液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)24h，傳代培養(yǎng)2～3代后，取2mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的菌體培養(yǎng)物置于無菌EP管內(nèi)，4℃下8000×g離心3min收集菌體，棄上清，采用乳酸菌專用CTAB凍融法提取菌株的基因組DNA；

以菌體DNA為擴(kuò)增模板，采用通用引物PCR擴(kuò)增16SrRNA基因區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行16SrRNA基因序列測(cè)定，然后通過基因序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究進(jìn)行種屬鑒定，待試菌株鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)；

C、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測(cè)定植物乳桿菌對(duì)氧化樂果、甲拌磷和樂果的降解率

(1)待試菌株接種到MRS培養(yǎng)基中活化，連續(xù)轉(zhuǎn)接三次，每次37℃培養(yǎng)24h培養(yǎng)，活化三代的待試菌株以接種量1×107cfu/mL接種到含0.5mg/kg氧化樂果、0.5mg/kg甲拌磷和0.5mg/kg樂果的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，取發(fā)酵液以4000×g離心10min，上清液經(jīng)0.22μm微膜過濾得到濾液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)取20g步驟(1)的濾液，置于50mL離心管中，加入15mL的丙酮-乙腈(1：4，v/v)混合液，輕輕搖動(dòng)均勻，靜置20min；然后搖動(dòng)30s后3600rpm離心5min，然后上層液體轉(zhuǎn)移到分液漏斗中；向上述分液漏斗中添加25mL的二氯甲烷，震蕩10min充分混勻，靜置10min；將分液漏斗中的下層液體放出到燒杯中，添加1g無水Na₂SO₄干燥20min；干燥后的提取液經(jīng)濾紙過濾后定容至50mL；取上述定容后的提取液過0.22μm的濾膜上氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀分別測(cè)定氧化樂果、甲拌磷和樂果濃度；

計(jì)算農(nóng)藥降解率，農(nóng)藥降解率計(jì)算公式：

降解率(％)＝(C₀-C₁)/C₀×100％

C₀——MRS空白組農(nóng)藥濃度；C₁——MRS乳酸菌發(fā)酵后的殘留濃度；

(3)挑選對(duì)三種有機(jī)磷農(nóng)藥都具有較好降解效果的待試菌株作進(jìn)一步測(cè)試；

D、測(cè)定待試菌株的胃腸液耐受性和膽鹽耐受性

獲得一株胃腸液耐受性高、膽鹽耐受性高、對(duì)氧化樂果和樂果的降解率>9％且對(duì)甲拌磷降解率>28％的菌株命名為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)P9。

4.權(quán)利要求1-3所述的具有農(nóng)藥降解活性的植物乳桿菌P9在食品或食品添加劑中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述食品是發(fā)酵食品或菌劑。

6.權(quán)利要求1-3所述的具有農(nóng)藥降解活性的植物乳桿菌P9在抗甜瓜疫霉菌中的應(yīng)用。