[發明專利]一種以黃花蒿懸浮細胞系為受體的轉AaADS基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法

有效

• 申請號: 201811328722.4
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109337925B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 趙燕;龍炎杏;張學文;肖楠;羅莎;謝心
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/60;A01H5/00;A01H6/14
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本發明公開了一種以黃花蒿懸浮細胞系為受體的轉AaADS基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，構建AaADS基因在黃花蒿腺毛細胞過表達的載體，利用根癌農桿菌介導法轉化黃花蒿懸浮細胞系，獲得轉基因黃花蒿植株。對轉基因黃花蒿植株進行PCR基因擴增檢測，并對轉基因黃花蒿腺毛細胞發育情況及青蒿素含量進行觀察與分析，篩選青蒿素含量顯著提高的轉基因黃花蒿植株，通過組織培養繁殖建立轉基因高青蒿素含量的黃花蒿品系。本發明獲得的轉基因黃花蒿中青蒿素含量顯著提高，過表達AaADS基因的黃花蒿中青蒿素的含量最高可達27.8mg/g DW，是非轉化黃花蒿含量的2.24倍。本發明對于為青蒿素的規模化生產提供高產、穩定新藥源具有重要意義。

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種以黃花蒿懸浮細胞系為受體的轉AaADS基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法。

背景技術

青蒿素是從植物黃花蒿中提取的含過氧基團的倍半萜內酯藥物，是當今瘧疾治療的最理想藥物，能有效治療對傳統藥物氯奎產生抗藥性的瘧原蟲感染。青蒿素主要從黃花蒿(Artemisia annua L.)中直接提取，或提取黃花蒿中含量較高的青蒿酸，然后半合成而成。目前除黃花蒿外，尚未發現含有青蒿素的其它天然植物資源。因此黃花蒿仍是青蒿素藥物生產的惟一藥源。

雖然黃花蒿系世界廣泛分布品種，但青蒿素含量隨產地不同差異極大。研究證明黃花蒿中合成青蒿素的主要部位是其葉片表面的腺毛細胞。由于其合成部位的特異性，黃花蒿中青蒿素的含量僅占葉片干重的0.8％—1.4％，因而使其分離成本高、產量低、廢棄物多。

野生黃花蒿中青蒿素含量很低，主要集中在0.1％—0.60％之間，高者也僅為0.8％左右。通過雜交和定向育種開展了大量提高黃花蒿中青蒿素含量的嘗試，但目前報道的最高青蒿素含量也未超過1.4％，說明了常規選育方法的局限性。

青蒿素主要在黃花蒿腺毛中合成、分泌及儲存，在其腺毛細胞中過表達青蒿素合成相關的功能基因，能有效地加快青蒿素前體物質合成速度和合成量，提高腺毛細胞代謝水平從而增加黃花蒿中青蒿素的合成，進而提高黃花蒿中青蒿素的含量。

發明內容

本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種以黃花蒿懸浮細胞系為受體的轉AaADS基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法。

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：

所述以黃花蒿懸浮細胞系為受體的轉AaADS基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法包括如下步驟：

(1)在黃花蒿腺毛細胞過表達基因的載體重組構建：

將青蒿素合成關鍵基因構建到Ti質粒的T-DNA區，以HPT基因為選擇標記基因，以pCAMBIA1301作為出發載體進行改造和載體構建；得到重組Ti質粒pCAMBIA1301-AaADSpro::AaADS，所述重組Ti質粒的序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)工程化根癌農桿菌的制備：

構建的重組Ti質粒通過電激轉化法轉化根癌農桿菌LBA4404(市售)，經過抗生素篩選和分子檢測驗證工程農桿菌，培養工程農桿菌至對數生長后期；

(3)黃花蒿懸浮細胞系的建立：

將深綠色或淡黃色生長快、結構疏松顆粒狀的黃花蒿愈傷組織置于100mLMS液體培養基中，將愈傷輕輕夾碎，搖床150r/min，光照周期為16h/8h光暗交替，溫度為25±2℃振蕩培養；培養15—20d左右為懸浮細胞的快速增長且細胞活性較高期，選取該時期期的直徑在5mm以內的小細胞團及含有單細胞的黃花蒿懸浮細胞系懸浮液，備用；

(4)黃花蒿懸浮細胞的共培浸染轉化：

將步驟(3)所得的黃花蒿懸浮細胞系懸浮液與步驟(2)中生長至對數生長后期的工程農桿菌共培2.5—3.5d，優選為3d，然后轉入篩選培養基上培養；