[發明專利]一種以黃花蒿懸浮細胞系為受體的轉AaADS基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法

有效

• 申請號: 201811328722.4
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109337925B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 趙燕;龍炎杏;張學文;肖楠;羅莎;謝心
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/60;A01H5/00;A01H6/14
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1.一種以黃花蒿懸浮細胞系為受體的轉AaADS基因提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)在黃花蒿腺毛細胞過表達基因的載體重組構建：

將青蒿素合成關鍵基因構建到Ti質粒的T-DNA區，以HPT基因為選擇標記基因，以pCAMBIA1301作為出發載體進行改造和載體構建；得到重組Ti質粒pCAMBIA1301-AaADSpro::AaADS，所述重組Ti質粒的序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)工程化根癌農桿菌的制備：

構建的重組Ti質粒通過電激轉化法轉化根癌農桿菌LBA4404，經過抗生素篩選和分子檢測驗證工程農桿菌，培養工程農桿菌至對數生長后期；

(3)黃花蒿懸浮細胞系的建立：

將深綠色或淡黃色生長快、結構疏松顆粒狀的黃花蒿愈傷組織置于MS液體培養基中，將愈傷輕輕夾碎，搖床150r/min，光照周期為16h/8h光暗交替，溫度為25±2℃振蕩培養；培養15—20d為懸浮細胞的快速增長且細胞活性較高期，選取該時期的直徑在5mm以內的小細胞團及含有單細胞的黃花蒿懸浮細胞系懸浮液，備用；

(4)黃花蒿懸浮細胞的共培浸染轉化：

將步驟(3)所得的黃花蒿懸浮細胞系懸浮液與步驟(2)中生長至對數生長后期的工程農桿菌共培2.5—3.5d，然后轉入篩選培養基上培養；

(5)轉化細胞的篩選和獲得抗性愈傷組織：

經步驟(4)共培2.5—3.5d后的黃花蒿懸浮細胞經MS液體培養基沖洗后，置于含200mg/L羧芐青霉素和30mg/LHPT抗性的誘導愈傷及叢生芽分化的培養基上，培養至愈傷上有叢生芽的分化(6周左右)，獲得抗性叢生芽并繼代增殖；

(6)誘導根分化和獲得轉基因植株：

當抗性叢生芽生長至3—5cm大小時，將抗性叢生芽轉移到生根培養基誘導根分化，分化后幼苗經過煉苗后移栽至營養基質中，獲得轉基因植株；

(7)轉基因植株的分子檢測和腺毛細胞發育觀察：

提取轉基因植株葉片的DNA，用PCR法進行目的基因的分子檢測驗證，通過體視熒光顯微鏡觀察轉基因植株葉片腺毛細胞的密度、大小及熒光強度，通過與對照的比較判斷腺毛的發育情況，對腺毛發育具有顯著促進的植株進行青蒿素含量測定；

(8)建立轉基因黃花蒿品系：

篩選青蒿素含量顯著提高的轉基因黃花蒿植株，通過組織培養繁殖建立轉基因高青蒿素含量的黃花蒿品系。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)是從GenBank中的Nucleotide數據庫中獲得AaADS啟動子序列及CDS序列信息，設計克隆和同源重組引物，以黃花蒿基因組DNA和cDNA為模板，通過PCR擴增技術，獲得AaADS基因的啟動子序列和CDS序列，構建在腺毛細胞過表達的重組Ti質粒pCAMBIA1301-AaADSpro::AaADS。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，構建在腺毛細胞過表達的重組Ti質粒pCAMBIA1301-AaADSpro::AaADS所用引物如下：

上游引物AaADSpro-UP1：CTTACCTCCCGACCTCTCATGAC；

下游引物AaADSpro-DN1：CATTCACTATCTGTTCCACCCCTTG；

上游引物AaADS UP1：CCATCAAGCTAAGAGCAACTCTAG；

下游引物AaADSDN1：CTATGCACGAAGGATTGGTAGT；

上游同源重組引物AaADSrpo-Hind III-UP2：

AGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCTTACCTCCCGACCTCTCATG；

下游同源重組引物AaADSpro-Nco I-DN2：

GAAATTTCCCTCAGATCTACCATGGGATTTTCAAAACTTTGAATATATGTGG；

上游同源重組引物引物AaADS UP2：

TTCAAAGTTTTGAAAATCCCATGGATGTCACTTACAGAAGAAAAACCTATTCGCC；

下游同源重組引物引物AaADSDN2：

GATCGGGGAAATTCGAGCTGGTGACCTCATATACTCATAGGATAAACGAGTAGAGAC。