[發(fā)明專利]用于EB病毒DNA檢測的引物和crRNA及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811326480.5
• 申請日: 2018-11-08
• 公開（公告）號: CN111154913B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾木圣;吳業(yè)濤;劉尚鑫;王芳
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝;舒勝英

本發(fā)明公開了用于檢測EB病毒(Epstein?Barr?virus)DNA的一種特異性引物和一種特異性靶向檢測EB病毒的crRNA，以及對鼻咽癌患者進(jìn)行EB病毒DNA檢測的方法。采用本發(fā)明方法可在不依賴實時熒光定量PCR(qPCR)儀等復(fù)雜儀器情況下檢測EB病毒DNA，獲得的結(jié)果與qPCR法檢測結(jié)果基本一致，臨床血漿樣檢測靈敏度96％，特異度100％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腫瘤診斷領(lǐng)域，具體涉及與腫瘤診斷相關(guān)的分子檢測，更具體涉及一種EB?病毒DNA的特異性檢測引物和一種靶向EB病毒的特異性crRNA，以及利用該引物和crRNA?對鼻咽癌患者進(jìn)行EB病毒DNA的定量檢測方法。

背景技術(shù)

鼻咽癌(Nasopharyngeal?carcinoma，NPC)是發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。在中國華南地區(qū)鼻咽癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率高達(dá)20/100000，故亦稱廣東癌，在所有惡性腫瘤發(fā)病率中排名前十。

臨床研究顯示血漿EB病毒DNA水平是鼻咽癌的獨(dú)立生物標(biāo)志物。Mutirangura等首次發(fā)現(xiàn)能從鼻咽癌患者血漿中檢測到EB病毒DNA(Clinical?Cancer?Research,1998)。在此研究基礎(chǔ)上，盧煜明院士利用實時熒光定量PCR技術(shù)分別檢測鼻咽癌患者和健康人血漿中的EB?病毒DNA，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者血漿中EB病毒DNA陽性率顯著高于健康人，血漿中EB病毒DNA含量可作為鼻咽癌篩查方法(Cancer?Research,1999)。曾木圣課題組通過利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測鼻咽癌患者血漿中EB病毒DNA含量，可對鼻咽癌患者進(jìn)行分期(Journalof?the?National?Cancer?Institute，2015)。

然而，實時熒光定量PCR技術(shù)所需要的儀器較為復(fù)雜，難以在偏遠(yuǎn)地區(qū)進(jìn)行推廣。RPA，即重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，主要依賴重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增，是一種可以替代傳統(tǒng)PCR的新型核酸檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種用于EB病毒DNA檢測的特異性引物和特異性crRNA，以及利用該引物和crRNA對鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA的早期快速定量檢測方法，該方法具有不依賴qPCR儀等復(fù)雜儀器等特點(diǎn)。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種用于檢測EB病毒DNA的引物對，其正向引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，其反向引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

一種用于檢測EB病毒DNA的crRNA，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。

一種檢測EB病毒DNA的試劑盒，其特征在于：包含上述所述的引物對和crRNA。

進(jìn)一步的，上述試劑盒中還含有LwCas13a蛋白和底物報告RNA?RNase?alert?v2。

進(jìn)一步的，上述試劑盒中還含有RNA酶抑制劑，ATP，GTP，UTP，CTP，T7聚合酶，MgCl₂和MgAc。

一種檢測EB病毒DNA的方法，包括以下步驟：

1)提取待測樣品DNA，得模板；

2)將所得模板DNA在反應(yīng)體系進(jìn)行相應(yīng)的反應(yīng)程序，先利用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)和上述所述引物對在25～37℃條件下對模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，然后在25～37℃條件下對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA，使用上述所述的crRNA、LwCas13a在25～37℃條件下對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號檢測；上述所有擴(kuò)增反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均的同一反應(yīng)體系中進(jìn)行或分開在不同體系中進(jìn)行；

3)根據(jù)熒光信號值對待測樣品中EB病毒DNA進(jìn)行定量。

進(jìn)一步的，上述同一反應(yīng)體系為每100μL反應(yīng)體系中包括：