[發明專利]用于EB病毒DNA檢測的引物和crRNA及其應用

有效

• 申請號: 201811326480.5
• 申請日: 2018-11-08
• 公開（公告）號: CN111154913B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 曾木圣;吳業濤;劉尚鑫;王芳
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝;舒勝英

1.一種用于檢測EB病毒DNA的引物對和crRNA，所述引物對的正向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:?1所示，所述引物對的反向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:?2所示；所述crRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:?3所示。

2.一種檢測EB病毒DNA的試劑盒，其特征在于：包含權利要求1所述的引物對和crRNA。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：該試劑盒中還含有LwCas13a蛋白和RNA底物報告物，所述RNA底物報告物為RNase?Alert?v2。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：該試劑盒中還含有RNA酶抑制劑，ATP，GTP，UTP，CTP，T7?聚合酶，MgCl₂和MgAc₂。

5.權利要求1所述的引物對和crRNA在制備檢測EB病毒DNA的試劑盒中的應用，其特征在于：所述試劑盒的使用方法包括以下步驟：

1）提取待測樣品DNA，得模板；

2）將所得模板DNA在反應體系進行相應的反應程序，先利用重組酶聚合酶擴增技術和權利要求1中所述的引物對在25～37℃條件下對模板DNA進行擴增反應，然后在25～37℃條件下對擴增產物進行轉錄反應得到轉錄產物RNA，使用權利要求1中所述的crRNA和LwCas13a在25～37℃條件下對轉錄產物進行熒光信號檢測；上述所有擴增反應和轉錄反應均的同一反應體系中進行或分開在不同體系中進行；

3）根據熒光信號值對待測樣品中EB病毒DNA進行定量。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：所述同一反應體系為每100μL?反應體系中包括：

0.48μM?SEQ?ID?NO:?1所示正向引物

0.48μM?SEQ?ID?NO:?2所示反向引物

1×?RPA再水合緩沖液

模板DNA

45nM?LwCas13a蛋白

22.5nM?SEQ?ID?NO:?3所示crRNA

125nM?RNA底物報告物

2.5μL鼠RNA酶抑制劑

2mM?ATP

2mM?GTP

2mM?UTP

2mM?CTP

1μL?T7?聚合酶混合物

5mM?MgCl₂

14mM?MgAc₂；

所述RNA底物報告物為RNase?Alert?v2。

7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：步驟2）中，所述熒光信號檢測的程序為：在熒光讀板儀中于25～37℃條件下反應2~3?h，每4~6分鐘測量一次熒光信號。