[發明專利]一種利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法

在審

• 申請號: 201811325558.1
• 申請日: 2018-11-08
• 公開（公告）號: CN109536528A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 靖超
• 申請（專利權）人: 武漢纖然生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/90
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 祝蓉蓉;徐瑛

本發明公開了一種利用CRISPR?Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法，通過先對動物膠質瘤腫瘤細胞的凍存細胞進行單克隆培養，然后選用CRISPR?Cas9基因技術，針對于MDR1設計各自的sgRNA，并將其插入至腺病毒中并在轉染細胞中連續PCR擴增，獲得大量病毒液，最后將腺病毒價值膠質瘤腫瘤細胞中，敲除對應的基因片段，從而避免了因這些基因片段損傷突變而使膠質瘤細胞產生耐藥性，這種方法基因消除效率高，有助于研究膠質瘤腫瘤耐藥的機理，研發更有效的抗腫瘤靶向藥。

技術領域

本發明屬于基因技術領域，特別是一種利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法。

背景技術

CRISPR是一種來自細菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。目前，CRISPR-Cas9系統應用最為廣泛。Cas9蛋白含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然后通過PAM序列結合并侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。由于PAM序列結構簡單(5’-NGG-3’)，幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點，因此得到廣泛的應用。CRISPR-Cas9系統已經成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統。

雖然普通質粒很多時候也能達到實驗效果，但是質粒轉染具有效率低，作用時間短暫性等缺點。病毒的出現解決了質粒這些問題，腺病毒載體法是基因治療中最有前途的基因轉移方法之一。載體容易構建和操作，宿主范圍廣，感染性強，腺病毒載體能有效地將外源基因轉移到各種靶細胞或組織中。可經不同途徑進入不同組織，能感染分化后的非分裂期細胞，并且腺病毒基因不整合到宿主細胞中，無插入突變激活癌基因的危險，外源基因能游離地表達。近年，腺病毒載體引起了科研人員的關注，廣泛用于遺傳病、傳染病和腫瘤等疾病的基因治療的研究和應用。

腫瘤具有多基因型的特征，且基因變異驅使腫瘤的惡性發展和化療耐藥，糾正或刪除這些變異基因是未來腫瘤治療發展的一個方向。膠質瘤是源自神經上皮的腫瘤統稱為腦膠質瘤，占顱腦腫瘤的40％～50％，是最常見的顱內惡性腫瘤。年發病率為3～8人/10萬人口。目前，膠質瘤化療所選用的主要藥物為吉非替尼、厄洛替尼、奧斯替尼等，但在長期使用過程中，部分膠質瘤腫瘤細胞由于基因片段的損傷、突變，產生了耐藥性，導致腫瘤化療失敗。經研究發現，導致膠質瘤腫瘤細胞產生耐藥性的基因片段主要有MDR1，通過采用基因編輯、敲除等技術，能夠敲除這些基因，培育出缺失MDR1等基因片段，從而對上述藥物缺乏耐藥性的腫瘤細胞模型，是一種膠質瘤的基因治療的有效輔助手段。然而，目前的基因敲除中，尚未發現有關敲除MDR1基因片段，建立腫瘤模型的技術。

發明內容

本發明提供了一種利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法，具體通過以下技術實現。

一種利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法，包括以下步驟：

A1、取動物膠質瘤腫瘤細胞凍存細胞進行單克隆培養，得膠質瘤腫瘤細胞懸液，備用；

A2、針對MDR1中的蛋白質編碼序列，通過CRISPR在線設計工具分別設計針對于MDR1的sgRNA；所述MDR1的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

A3、將各sgRNA分別插入到腺病毒載體中，使其能表達，得重組腺病毒載體；

A4、將重組腺病毒載體轉染至轉染細胞中，直至出現明顯細胞病變后，收集細胞，凍融釋放病毒，在轉染細胞中連續PCR擴增，獲得大量病毒液，分層純化病毒液，得高濃重組腺病毒載體；

A5、將高濃重組腺病毒載體加至膠質瘤腫瘤細胞懸液中，敲除膠質瘤腫瘤細胞的MDR1基因，得動物腫瘤模型。

優選地，步驟A3中，所述腺病毒載體含有綠色熒光標簽蛋白。