[發明專利]一種利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法在審
| 申請號： | 201811325558.1 | 申請日： | 2018-11-08 |
| 公開（公告）號： | CN109536528A | 公開（公告）日： | 2019-03-29 |
| 發明（設計）人： | 靖超 | 申請（專利權）人： | 武漢纖然生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/861 | 分類號： | C12N15/861;C12N15/90 |
| 代理公司： | 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224 | 代理人： | 祝蓉蓉;徐瑛 |
| 地址： | 430000 湖北省武漢市東湖新技術開發區高新大道6*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 動物腫瘤模型 基因片段 技術構建 腫瘤細胞 膠質瘤 腺病毒 單克隆培養 膠質瘤細胞 耐藥性 動物膠質 基因技術 基因消除 抗腫瘤靶 腫瘤耐藥 轉染細胞 連續PCR 基因 病毒液 凍存 擴增 敲除 研發 突變 損傷 細胞 研究 | ||
1.一種利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法，其特征在于，包括以下步驟：
A1、取動物膠質瘤腫瘤細胞凍存細胞進行單克隆培養，得膠質瘤腫瘤細胞懸液，備用；
A2、針對MDR1中的蛋白質編碼序列，通過CRISPR在線設計工具分別設計針對于MDR1的sgRNA；所述MDR1的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
A3、將各sgRNA插入到腺病毒載體中，使其能表達，得重組腺病毒載體；
A4、將重組腺病毒載體轉染至轉染細胞中，直至出現明顯細胞病變后，收集細胞，凍融釋放病毒，在轉染細胞中連續PCR擴增，獲得大量病毒液，分層純化病毒液，得高濃重組腺病毒載體；
A5、將高濃重組腺病毒載體加至膠質瘤腫瘤細胞懸液中，敲除膠質瘤腫瘤細胞的MDR1基因，得動物腫瘤模型。
2.根據權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法，其特征在于，步驟A3中，所述腺病毒載體含有綠色熒光標簽蛋白。
3.根據權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法，其特征在于，針對于MDR1的各自所述sgRNA序列的設計選擇在第一外顯子。
4.根據權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法，其特征在于，所述腺病毒載體為Ad5F35腺病毒載體。
5.根據權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法，其特征在于，步驟A4的所述轉染細胞為HEK293轉染細胞。
6.根據權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建動物腫瘤模型的方法，其特征在于，所述PCR引物為：正向引物為5'-gcagggcgtgagcattagat-3'，反向引物為5'-gagttggcgacaaggacagaa-3'。
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