[發明專利]弓形蟲SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒構建的方法及重組腺病毒和應用

有效

• 申請號: 201811322996.2
• 申請日: 2018-11-08
• 公開（公告）號: CN109554390B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 陳啟軍;張東超;姜寧
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;C12N7/01;A61K39/002;A61P33/02
• 代理公司: 遼寧沈陽國興知識產權代理有限公司 21100
• 代理人: 姜婷婷

本發明公開了一種弓形蟲SAG2（表面抗原2）基因和MIC3（微線體蛋白3）基因重組腺病毒構建的方法及重組腺病毒和應用。從Toxoplasma gondii RH株中分別擴增出SAG2基因和MIC3基因，將獲得的目的基因克隆到穿梭載體pHBAd?EF1a?MCS?3flag?CMV?EGFP中，利用脂質體轉染法將重組腺病毒穿梭質粒pHBAd?SAG2?MIC3?EGFP與腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉染HEK293A細胞，重組并包裝獲得含有SAG2基因和MIC3基因的重組腺病毒Ad?SAG2?MIC3?EGFP；將此重組腺病毒免疫Balb/c小鼠后，小鼠的抗體水平得到顯著提高，活化的TCL和Th淋巴細胞比例顯著增高，IF?γ、IL?6和TN?α等細胞因子顯著增高，且對Balb/c小鼠產生一定的保護作用。

技術領域

本發明屬于基因生物工程領域，涉及構建重組腺病毒的方法，具體說，是一種利用Toxoplasma gondii SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒構建的方法及重組腺病毒和應用。

背景技術

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是專性細胞內有核寄生的頂覆門原蟲，是危害嚴重的食源性人獸共患寄生蟲，能感染畜禽和人在內的200余種動物。人類感染率約為25％～50％，全球約有5～10億人感染弓形蟲病；弓形蟲致死性爆發可造成畜禽大量死亡，豬爆發弓形蟲病時，死亡率達60％。弓形蟲不僅直接危害畜牧業的發展和產品質量安全，而且可因肉食品安全而引發公共衛生和生物恐慌事件，影響社會穩定。

目前，弓形蟲的常規疫苗種類包括滅活疫苗、減毒活疫苗、蟲體特異組分疫苗和重組蛋白疫苗。但還沒有可用于人的弓形蟲疫苗，部分國家使用的獸用弓形蟲疫苗也僅有一種：S48弱毒株疫苗。因此，研發新型疫苗是控制弓形蟲感染和傳播的迫切需求。基因工程苗同時具備弱毒疫苗和滅活疫苗的優點，尤其多價基因工程疫苗對控制疫病的傳播更具優勢。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒構建的方法及重組腺病毒和應用，將T.gondii的入侵相關蛋白的基因SAG2和MIC3與腺病毒載體系統高效穩定表達外源基因的特性結合起來，構建出能夠表達上述蛋白質的重組腺病毒，分別檢測免疫鼠后機體內產生的抗T.gondii抗體的水平、淋巴細胞比例和細胞因子變化等指標，并通過免疫攻蟲保護試驗檢測其免疫保護效果，評價研制的預防弓形蟲病的二價基因工程活載體疫苗。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種SAG2基因和MIC3基因構建重組腺病毒的方法，包括以下步驟：

1)從T.gondii RH株中分別擴增出SAG2基因序列GI：M33572.1和MIC3基因序列GI：AJ132530.1；

所述的SAG2基因和MIC3基因的擴增包括：以SAG2-F SEQ ID NO.1和SAG2-R SEQID NO.2為引物，以RH株的RNA為模板，RT-PCR擴增獲得SAG2基因；以MIC3-F SEQ ID NO.3和MIC3-R SEQ ID NO.4為引物，以RH株的RNA為模板，RT-PCR擴增獲得MIC3基因；

2)將目的基因重組至腺病毒穿梭質粒，獲得的重組質粒pHBAd-SAG2-MIC3-EGFP與腺病毒大骨架質粒pBHGlox E1,3Cre共轉染HEK293A細胞，重組并包裝獲得重組腺病毒Ad-SAG2-MIC3-EGFP。

所述的T.gondii SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒的構建方法制備的重組腺病毒。

所述的T.gondii SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒的構建方法制備的重組腺病毒在預防弓形蟲中的應用。