[發(fā)明專利]弓形蟲SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒構(gòu)建的方法及重組腺病毒和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811322996.2
• 申請(qǐng)日: 2018-11-08
• 公開（公告）號(hào): CN109554390B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳啟軍;張東超;姜寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/861
• 分類號(hào): C12N15/861;C12N15/66;C12N7/01;A61K39/002;A61P33/02
• 代理公司: 遼寧沈陽國(guó)興知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21100
• 代理人: 姜婷婷

本發(fā)明公開了一種弓形蟲SAG2（表面抗原2）基因和MIC3（微線體蛋白3）基因重組腺病毒構(gòu)建的方法及重組腺病毒和應(yīng)用。從Toxoplasma gondii RH株中分別擴(kuò)增出SAG2基因和MIC3基因，將獲得的目的基因克隆到穿梭載體pHBAd?EF1a?MCS?3flag?CMV?EGFP中，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pHBAd?SAG2?MIC3?EGFP與腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，重組并包裝獲得含有SAG2基因和MIC3基因的重組腺病毒Ad?SAG2?MIC3?EGFP；將此重組腺病毒免疫Balb/c小鼠后，小鼠的抗體水平得到顯著提高，活化的TCL和Th淋巴細(xì)胞比例顯著增高，IF?γ、IL?6和TN?α等細(xì)胞因子顯著增高，且對(duì)Balb/c小鼠產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因生物工程領(lǐng)域，涉及構(gòu)建重組腺病毒的方法，具體說，是一種利用Toxoplasma gondii SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒構(gòu)建的方法及重組腺病毒和應(yīng)用。

背景技術(shù)

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是專性細(xì)胞內(nèi)有核寄生的頂覆門原蟲，是危害嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲，能感染畜禽和人在內(nèi)的200余種動(dòng)物。人類感染率約為25％～50％，全球約有5～10億人感染弓形蟲病；弓形蟲致死性爆發(fā)可造成畜禽大量死亡，豬爆發(fā)弓形蟲病時(shí)，死亡率達(dá)60％。弓形蟲不僅直接危害畜牧業(yè)的發(fā)展和產(chǎn)品質(zhì)量安全，而且可因肉食品安全而引發(fā)公共衛(wèi)生和生物恐慌事件，影響社會(huì)穩(wěn)定。

目前，弓形蟲的常規(guī)疫苗種類包括滅活疫苗、減毒活疫苗、蟲體特異組分疫苗和重組蛋白疫苗。但還沒有可用于人的弓形蟲疫苗，部分國(guó)家使用的獸用弓形蟲疫苗也僅有一種：S48弱毒株疫苗。因此，研發(fā)新型疫苗是控制弓形蟲感染和傳播的迫切需求。基因工程苗同時(shí)具備弱毒疫苗和滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)，尤其多價(jià)基因工程疫苗對(duì)控制疫病的傳播更具優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒構(gòu)建的方法及重組腺病毒和應(yīng)用，將T.gondii的入侵相關(guān)蛋白的基因SAG2和MIC3與腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的特性結(jié)合起來，構(gòu)建出能夠表達(dá)上述蛋白質(zhì)的重組腺病毒，分別檢測(cè)免疫鼠后機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的抗T.gondii抗體的水平、淋巴細(xì)胞比例和細(xì)胞因子變化等指標(biāo)，并通過免疫攻蟲保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)其免疫保護(hù)效果，評(píng)價(jià)研制的預(yù)防弓形蟲病的二價(jià)基因工程活載體疫苗。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種SAG2基因和MIC3基因構(gòu)建重組腺病毒的方法，包括以下步驟：

1)從T.gondii RH株中分別擴(kuò)增出SAG2基因序列GI：M33572.1和MIC3基因序列GI：AJ132530.1；

所述的SAG2基因和MIC3基因的擴(kuò)增包括：以SAG2-F SEQ ID NO.1和SAG2-R SEQID NO.2為引物，以RH株的RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得SAG2基因；以MIC3-F SEQ ID NO.3和MIC3-R SEQ ID NO.4為引物，以RH株的RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得MIC3基因；

2)將目的基因重組至腺病毒穿梭質(zhì)粒，獲得的重組質(zhì)粒pHBAd-SAG2-MIC3-EGFP與腺病毒大骨架質(zhì)粒pBHGlox E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，重組并包裝獲得重組腺病毒Ad-SAG2-MIC3-EGFP。

所述的T.gondii SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒。

所述的T.gondii SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒在預(yù)防弓形蟲中的應(yīng)用。