[發(fā)明專利]弓形蟲SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒構(gòu)建的方法及重組腺病毒和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811322996.2
• 申請(qǐng)日: 2018-11-08
• 公開（公告）號(hào): CN109554390B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳啟軍;張東超;姜寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/861
• 分類號(hào): C12N15/861;C12N15/66;C12N7/01;A61K39/002;A61P33/02
• 代理公司: 遼寧沈陽國興知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21100
• 代理人: 姜婷婷

1.一種弓形蟲SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）從Toxoplasma gondii RH株中分別擴(kuò)增出SAG2基因序列GI：M33572.1和MIC3基因序列AJ132530.1；

所述的SAG2基因和MIC3基因的擴(kuò)增包括：以SAG2-F SEQ ID NO.1和SAG2-R SEQ IDNO.2 為引物，以RH株的RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得SAG2基因；以MIC3-F SEQ ID NO.3和MIC3-R SEQ ID NO.4為引物，以RH株的RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得MIC3基因；

2）將目的基因重組至腺病毒穿梭質(zhì)粒，獲得的重組質(zhì)粒pHBAd-SAG2-MIC3-EGFP與腺病毒大骨架質(zhì)粒pBHGlox E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，重組并包裝獲得重組腺病毒Ad-SAG2-MIC3-EGFP。

2.如權(quán)利要求1所述的SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒。

3.如權(quán)利要求1所述的SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒在制備預(yù)防弓形蟲病中的藥物中的應(yīng)用。

4.如權(quán)利要求1所述的一種弓形蟲SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于所述的步驟1中，腹腔接種T. gondii RH株于Balb/c小鼠，收集的小鼠腹腔液，純化速殖子，利用Trizol法提取蟲體RNA。

5.如權(quán)利要求1所述的一種弓形蟲SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于所述的步驟2中，將獲得的SAG2基因和MIC3基因先后與穿梭載體pHBAd-EF1a-MCS-3flag-CMV-EGFP用相應(yīng)的酶進(jìn)行雙酶切，再將其用T4連接酶16℃連接12 h，經(jīng)菌液PCR、酶切及測(cè)序鑒定，篩選出正確的重組穿梭質(zhì)粒pHBAd-SAG2-MIC3-EGFP。

6.如權(quán)利要求1所述的一種弓形蟲SAG2基因和MIC3基因重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于所述的步驟2中，取脂質(zhì)體15.0 μL，并將其與3μg腺病毒穿梭質(zhì)粒pHBAd-SAG2-MIC3-EGFP和6μg腺病毒大骨架質(zhì)粒pBHGloxE1,3Cre混勻，共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，使其在HEK293A細(xì)胞中重組與包裝14 d，收集CPE細(xì)胞，反復(fù)凍融并收集病毒，凍存-80℃。