[發明專利]一種發酵生產丁酸的方法

在審

• 申請號: 201811322835.3
• 申請日: 2018-11-08
• 公開（公告）號: CN109355318A
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 王菊芳;傅宏鑫;廖正平;索玉凱;張亞南;胡佳磊;郭曉龍
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12P7/52
• 分類號: C12P7/52;C12R1/145
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

本發明屬于生物技術領域，公開了一種發酵生產丁酸的方法，包括如下步驟：(1)將酪丁酸梭菌(Clostrdium tyrobutyricum)活化，制備成種子液；(2)以甘露醇和葡萄糖的混合物為碳源，配制液體培養基，并經過滅菌；(3)將步驟(1)種子液接種于步驟(2)的液體培養基中，在溫度為35?39℃，pH為5?7，轉速為100?300rpm的條件下，進行細胞發酵，得到丁酸。本發明可以降低副產物乙酸的積累，提高目標產物丁酸的轉化率和選擇性，從而降低后續的分離純化成本。此外，該發明中的混合底物還可以用褐藻水解液或褐藻加工廢棄物作為替代，從而實現廉價海洋生物質向高選擇性丁酸的高效生物轉化。

技術領域

本發明涉及一種利用酪丁酸梭菌以葡萄糖和甘露醇為混合底物發酵生產高選擇性丁酸的方法，屬于有機酸發酵技術領域。

背景技術

丁酸(butyric acid)又稱酪酸，是指含四個碳原子的直鏈飽和一元脂肪酸，常以游離狀態或酯的形式存在于自然界中。丁酸及其衍生物在化工、食品、醫藥和飼料行業等領域有著廣泛的用途。

目前，丁酸的生產主要有化學合成和微生物發酵兩種方法。在丁酸工業化生產中，丙烯羰基合成法和正丁醛氧化法是最常用的方法。其中，丙烯羰基合成法主要是通過糖基化作用先將丙烯轉化為丁醛，然后再將丁醛氧化為丁酸，但此方法存在投資較大，原料費用較高，色澤度不理想等缺點，并且副產物丁醛的存在也降低了丁酸的得率和純度，這大大增加了后續分離純化成本；而正丁醛氧化法是通過氧化正丁醛生產丁酸，并且在反應中無需采用催化劑從而避免了后續分離催化劑與產物的工序，此外其還具有合成工藝簡單、原料成本較低、生產控制方便、底物轉化率高(>99％)、產物色澤好等優點，因此是目前工業生產丁酸普遍采用的方法。與化學合成法相比，微生物發酵法產丁酸具有可再生、污染低、能耗低等優點，并且人們對有機食品的偏愛也使得生物源丁酸更適用于食品、醫藥和飼料行業。

在厭氧條件下，自然界中有許多微生物都能夠通過發酵產丁酸，目前已經被證實的主要有梭菌屬(Clostridium)、丁酸桿菌屬(Butyribacterium)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、真桿菌屬(Eubacterium)、八疊球菌屬(Sarcina)、巨球形菌屬(Megasphaera)、梭桿菌屬(Fusobacterium)等。其中，厭氧梭菌在發酵產丁酸方面被研究的較多，并且因其較高的丁酸產量和產率以及清晰的代謝途徑等原因被認為更具有工業應用前景。厭氧梭菌一般為典型的革蘭氏陽性菌，嚴格厭氧，并且在惡劣環境中可以通過形成芽孢增強自身對外界環境的適應能力，其中酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)能夠利用葡萄糖、木糖和果糖合成丁酸、乙酸、二氧化碳和氫氣，由于其具有較好的丁酸產量和選擇性、較好的穩定性和較低的營養需求等優點，被認為是最具商業化開發潛力的丁酸發酵菌株。但是目前微生物發酵法產丁酸存在得率低和分離純化成本高等問題，嚴重制約了生物丁酸的工業化生產。因此，如何降低副產物的生成已經成為微生物發酵法產丁酸能否工業化的先決條件。

甘露醇是大型褐藻(如海帶、馬尾藻等)的主要成分之一，約占干重的10％～20％。目前，大型海藻通過物理、化學和生物酶法處理，提取海藻酸，而甘露醇成為主要的副產物被廢棄。若能將褐藻水解液或廢棄的甘露醇用于高選擇性丁酸生產，不僅可以變廢為寶，降低丁酸生產成本，還能減輕環境污染，緩解能源危機。與目前廣泛研究的廉價農業廢棄物相比，海洋生物質具有以下優勢：生長速度快、產量高、光合作用效率高、CO₂固定效率高、不含難降解的木質素，不與糧食作物爭奪土地、肥料、淡水等資源。因此，開發廉價海洋生物質轉化高選擇性丁酸的方法具有相當大的潛力和重要意義。

目前丁酸發酵的底物主要為葡萄糖和農業廢棄物(如甘蔗渣和玉米皮)水解液，雖然后者解決了原料來源的問題，但是由于預處理過程中產生大量毒性抑制物，使得發酵產物濃度低。雖然脫毒可以緩解這一效應，但是會造成糖損失，產生額外的操作成本。使用以上兩種底物發酵還存在另一個瓶頸：那就是副產物乙酸的存在不僅降低了丁酸的得率，還會使得后續分離純化步驟繁瑣、成本較高。

發明內容