[發(fā)明專利]嵌合抗原受體DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44及其用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811319485.5
• 申請日: 2018-11-07
• 公開（公告）號: CN109467605A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王恩秀;汪晨;武國英
• 申請（專利權(quán)）人: 南京卡提醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

本發(fā)明公開了一種優(yōu)化的嵌合抗原受體DAP12?T2A?CD8α?MSLN scFv?NKp44及其用途，所述的嵌合抗原受體由胞內(nèi)第二傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域DAP12、T2A、CD8α信號肽、抗人MSLN單克隆抗體ss1輕鏈和重鏈可變區(qū)MSLN scFv、胞內(nèi)第一傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。該嵌合抗原受體用于修飾T淋巴細胞，修飾后的T細胞(CAR?T細胞)能用于MSLN陽性的惡性實體腫瘤的治療。在惡性實體腫瘤殺傷試驗中，明顯加強了CAR?T細胞對胰腺癌腫瘤細胞的殺傷能力，在臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出良好的安全性和抗腫瘤活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腫瘤免疫治療技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)獲得編碼嵌合抗原受體DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44的融合基因，將該基因片段插入慢病毒表達載體，包裝成慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)入人T淋巴細胞中，使T細胞表達該嵌合抗原受體。本發(fā)明還涉及編碼此類跨膜多肽的核酸、載體，以及用于免疫治療的在其表面表達所述CAR的免疫細胞。本發(fā)明所涉及的嵌合抗原受體修飾的T細胞能靶向并特異性殺傷MSLN陽性的腫瘤細胞，用于惡性實體腫瘤的治療，開辟了對用于治療癌癥的有效的過繼性免疫治療策略的道路。

背景技術(shù)

隨著腫瘤免疫學(xué)理論和臨床技術(shù)的發(fā)展，嵌合抗原受體T細胞療法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成為目前最有發(fā)展前景的腫瘤免疫療法之一[Schmitz M，et al.Chimeric antigen receptor-engineered T cellsforimmunotherapy of Cancer.J Biomed Biotechnol，2010，doi：10.1155/2010/956304.]。嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心部件，CAR能針對所選擇的免疫細胞重定向其特異性和反應(yīng)性，因此賦予T細胞HLA非依賴的方式識別腫瘤抗原的能力，這使得經(jīng)過CAR改造的T細胞相較與正常T細胞受體(TCR)應(yīng)答不同，不受MHC限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的殺傷腫瘤細胞的能力。

嵌合抗原受體(CAR)在T細胞上表達合成蛋白，其將抗體的抗原識別片段(如抗體單鏈可變區(qū)片段)與胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域融合。研究發(fā)現(xiàn)，以腫瘤特異性單克隆抗體的單鏈可變區(qū)(scFv)取代TCR的α，β鏈可變區(qū)，并將scFv直接和T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域連接，形成嵌合抗原受體(CAR)表達于T細胞表面，可通過scFv識別腫瘤特異性抗原，直接產(chǎn)生T細胞的活化信號，促進T細胞活化、增殖，特異性殺傷腫瘤細胞。該過程主要依賴CAR-T細胞表面的scFv對腫瘤抗原的特異性識別，免疫反應(yīng)的特異性和殺傷性較強。

間皮素(MSLN)是一種通過磷脂酰肌醇區(qū)(GPI)錨定在細胞膜上得糖蛋白。它最初合成的是一個69kDa的細胞表面蛋白。成熟過程中在弗林蛋白酶的作用下斷裂成兩段，C末端40kDa的片段錨定在膜上，N末端32kDa的片段以溶解的形式釋放出來，稱為巨核細胞增效因子(MPF)。MSLN在腹膜、胸膜腔和心包上的間皮細胞上表達，而在上氣管、卵巢、睪丸網(wǎng)、扁桃體和輸卵管的上皮細胞表面低表達。此外，MSLN被發(fā)現(xiàn)在間皮瘤、卵巢癌和肺癌等惡性腫瘤中高表達。賓夕法尼亞大學(xué)的一項研究表明，六名復(fù)發(fā)性漿液性卵巢癌患者注射表達二代CAR的MSLN CAR-T細胞治療后，沒有觀察到與輸注相關(guān)的急性不良事件(AE)和細胞因子釋放綜合癥。一名患者觀察到相關(guān)的3-4級AE，包括胸腔積液，呼吸急促和呼吸困難；2例患者伴有腹痛，腹水和便秘。在治療一個月后，所有六名患者在按照RECIST標準成像時顯示病情穩(wěn)定(SD)[Gregory L.，et al.Activity of Mesothelin-specific Chimeric AntigenReceptor T cells Against Pancreatic Carcinoma Metastases in a Phase 1Trial.Gastroenterology,2018.]