[發明專利]生產抗體片段的方法

有效

• 申請號: 201811318557.4
• 申請日: 2018-11-07
• 公開（公告）號: CN109943572B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 史家海;陳荔;危立坤;馮麗敏
• 申請（專利權）人: 香港城市大學
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/70;C07K16/00
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 喬雪微;劉依云

一種生產目標抗原抗體片段的方法，包括：至少兩次將包含所述目標抗原的免疫混合物施予軟骨魚；從軟骨魚采集血液樣本；從血液樣本從提取RNA；對所述RNA進行逆轉錄以獲得互補DNA，并且可選地擴增cDNA以獲得擴增的cDNA的混合物，然后進行純化。也公開了從鯊魚生產抗體片段的方法；從該方法獲得抗體片段；和包括該抗體片段的試劑盒。

技術領域

本申請涉及生產抗體片段的方法，特別但不排他地，涉及目標抗原從重鏈抗體為目標抗原生產抗體片段的方法。生產的該抗體片段可在生物醫藥領域或藥物研發中應用。

背景技術

單克隆抗體(mAbs)廣泛使用于生物技術和生物醫藥方面，從免疫診斷學中的目標蛋白的親和純化到疾病治療。mAbs具有五種免疫球蛋白類，尺寸是150kDa。它們主要的結構由兩個同一的重鏈(VH)和兩個輕鏈(VL)組成。mAbs是單特異性抗體，和由幾種不同的免疫細胞制成的多克隆抗體相反，mAbs由同一免疫細胞制成，即是由唯一母細胞的所有克隆體制成。但是，常規抗體的高成本和低穩定性限制了該抗體在藥物開發或診斷學中的應用。

1993年，Hamers-Casterman偶然想到來源于駱駝的重鏈抗體，該抗體不具有輕鏈抗體(HCAbs)。1995年，發現了軟骨魚的免疫球蛋白新抗原受體，也稱為IgNAR，其結構和功能與HCAbs相似。重鏈抗體僅由兩種重鏈組成，盡管僅具有可變的重鏈域，其也能連接抗原。最近，已經開發出了單域抗體(sdAb，也稱為納米抗體)。sdAb是由單個單體可變抗體結構域組成的抗體片段。sdAb來源于駱駝科HcAbs的VHH片段和軟骨魚IgNAR的VNAR片段。

和常規抗體相比，sdAb是具有高穩定性、高特異性、高溶解性和隱蔽表位識別性的最小的抗體。它們在多種診斷和藥物應用中具有潛在用途。將熒光蛋白融合到sdAb生成所謂的熒光蛋白基因質粒(chromobody)，其具有增加的熒光和改善的光譜特性。Chromobody可以用于識別和跟蹤在活體細胞中的不同區室的目標。因此，他們能增加使用活細胞顯微術的可能性并且有助于新功能的研究。在診斷生物探針應用中，預期sdAb能用作工具。由于它們的尺寸小，它們能在生物探針表面更密集地耦合。除了它們在指向不容易接近的表位上的優勢，它們的構象穩定性也使得其具有更高的抵抗力來應對表面再生的情況。當前，一些從駱駝獲得的sdAb已經進入治療人類疾病的臨床試驗。但是，由于養育駱駝的成本很高，這極大地阻礙了sdAb的開發。

因為單克隆抗體有大的復合結構并且需要特定的轉譯后糖基化，現時還未能成功地通過簡單微生物宿主生產。因此，它們必須要在哺乳動物細胞系中生產，其培養過程復雜并且成本高(由于介質昂貴、發酵時間長、結垢問題、使用氣體等)。得到的抗體利用酶聯免疫吸附測定(ELISAs)進行篩選以得到期望的特異性。但是，基于ELISA的篩選的生產量低，因為在mAb生產的初步階段期間，只有有限的雜交瘤上清液的數量(～100μl)能用于篩選并且這通常僅足夠對僅一個或兩個抗原測試mAb。雖然如今mAbs在溫和的條件下很好地生產和純化，但是它們仍然容易受到聚集、脫氨和氧化影響。

通過使用能在微生物宿主(例如，Fab區域、可變域或sdAb)中生成的抗體的特殊部分，能減少與尺寸相關的對抗體的限制。受進化驅動的工程技術的強大高生產量技術是分子展示技術(molecular display):生成大的(多)肽庫并且隨后用于篩選具有期望的生物和物理化學性質的變體。最常用的展示技術是噬菌體展示技術(phage display)。因絲狀噬菌體的粘性，經常需要利用嚴苛條件(例如，具有洗滌劑的緩沖劑)進行幾次集中清洗步驟，稱為“生物淘洗”的艱難過程，以移除非特異性噬菌體。

因此，仍強烈需要能有效降低成本的方法來高效地生產sdAb，且提供生產抗體的多樣性。

發明內容