[發明專利]基于Ngpiwi蛋白介導的牛源大腸桿菌基因敲除菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 201811318486.8
• 申請日: 2018-11-07
• 公開（公告）號: CN109593694B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 張安定;付磊;韓麗;靳澤華;周紅波
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平;馮超

本發明公開了一種基于Ngpiwi蛋白介導的牛源大腸桿菌基因敲除菌株及其構建方法；所述牛源大腸桿菌基因敲除菌株為在牛源大腸桿菌基因組上缺失潛在毒力相關基因的ORF序列或部分序列的缺失菌株。該方法首先成功構建帶有Ngpiwi和待缺失靶基因序列左右同源臂的重組質粒；其次將重組質粒化學轉化至牛源大腸桿菌中，在28℃傳代誘導雙交換重組，PCR篩選出缺失靶基因序列的菌株，之后在無抗生素培養基中37℃誘導質粒丟失，從而獲得缺失潛在毒力基因相關序列的菌株。該遺傳操作系統質粒較小，操作容易，應用廣泛，不存在潛在的脫靶效應，敲除效率較高，無抗性基因篩選標記，為牛源大腸桿菌基因工程疫苗的研發提供了優良工具。

技術領域

本發明涉及獸用生物制品技術領域，具體涉及一種基于Ngpiwi蛋白介導的牛源大腸桿菌基因敲除菌株及其構建方法。

背景技術

牛源大腸桿菌病是由病原性大腸桿菌感染牦牛引起的以腹瀉等為特征的疫病，該病的發病率約為10.1％，死亡率為2.5％，致死率為45％，嚴重威脅牦牛的健康及農戶的經濟利益，制約著西藏經濟的健康、快速發展，常常給養殖戶及農戶造成難以估量的經濟損失。

大腸桿菌是嚴重危害牦牛養殖業的重要疾病之一，由于其血清型復雜和抗生素的大量使用所導致耐藥菌株不斷增加，對腸道正常菌群造成不良影響，給防治工作帶來了巨大的挑戰和困難，隨著對抗生素濫用危害的重視，對于該病的預防必然依賴于好的生物安全防控措施和有效疫苗作為工具。

目前農戶多采用常規滅活疫苗，一般是采用流行的牦牛大腸桿菌強毒株制備全菌滅活疫苗，這類滅活疫苗安全性較好，不存在毒力返強等風險，但是也存在不能產生較好的交叉免疫保護，只對相同血清型的菌株感染具有免疫保護的效果。

隨著對大腸桿菌毒力基因的深入研究，開發基因工程弱毒疫苗將成為首要選擇。相比較其他疫苗，基因缺失疫苗具有多項優勢，針對性地敲除靶基因后，毒力明顯減弱并且不存在毒力返強的風險，但卻可以刺激宿主產生較高的體液免疫應答、細胞免疫應答及粘膜免疫應答，產生更好的免疫保護效力，還可以作為遞呈異源抗原的載體，構建出重組載體疫苗，用途更加廣泛。但遺憾的是，由于大腸桿菌基因組操作的困難，目前的基因組改造技術多采用的是抗性選擇，即使毒力下降明顯，也無法用作基因工程弱毒疫苗，這就限制了其開發為疫苗菌株的可能性。因此，構建牛源大腸桿菌基因敲除的無標記系統將是研制基因工程疫苗菌株的關鍵。

有學者報道了一種新的基因編輯技術gDNA/NgAgo系統，該系統能表現出對核酸進行高效的切割，還有低脫靶效應、對靶位點錯配的低容忍度以及易于設計和操作等優點。雖然對于該系統在真核生物中的基因編輯效應尚存在爭議，但在牛源大腸桿菌中的效果并無研究。所以我們嘗試該技術系統在牛源大腸桿菌中敲除aste基因等潛在的毒力相關基因。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種基于Ngpiwi蛋白介導的牛源大腸桿菌基因敲除菌株及其構建方法。本發明采用Ngpiwi蛋白構建了一套高效的、無分子標記的牛源大腸桿菌遺傳操作系統。

為實現上述目的，本發明所設計一種基于Ngpiwi蛋白介導的牛源大腸桿菌基因敲除菌株，所述牛源大腸桿菌基因敲除菌株為在牛源大腸桿菌基因組上缺失潛在毒力相關序列的缺失菌株，所述潛在毒力相關序列為潛在毒力相關基因(putative virulence-associated genes)的ORF序列或ORF的部分序列。

進一步地，所述潛在毒力相關序列選自編碼精氨酸代謝途徑中琥珀酰谷氨酸脫琥珀酰基因(succinyl-glutamate desuccinylase)ORF序列或ORF的部分序列，其中，編碼精氨酸代謝途徑中琥珀酰谷氨酸脫琥珀酰基因ORF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

再進一步地，所述牛源大腸桿菌基因敲除菌株為在牛源大腸桿菌基因組上缺失編碼精氨酸代謝途徑中琥珀酰谷氨酸脫琥珀酰基因(succinyl-glutamate desuccinylase)ORF序列的缺失菌株，命名為△aste-Ecoli。