[發明專利]基于Ngpiwi蛋白介導的牛源大腸桿菌基因敲除菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 201811318486.8
• 申請日: 2018-11-07
• 公開（公告）號: CN109593694B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 張安定;付磊;韓麗;靳澤華;周紅波
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平;馮超

1.一種基于Ngpiwi蛋白介導的牛源大腸桿菌基因敲除菌株的構建方法，所述牛源大腸桿菌基因敲除菌株為在牛源大腸桿菌基因組上缺失潛在毒力相關序列的缺失菌株，所述潛在毒力相關序列為潛在毒力相關基因的ORF序列或ORF的部分序列；其特征在于：包括以下步驟：

1）構建帶有Ngpiwi基因的溫敏自殺基礎質粒pSHK5TS-NgPiwi；

a.以Natronobacterium gregoryi Piwi基因序列如SEQ ID No.2所示和ribosomebinding site片段序列如SEQ ID No.3所示為模板，設計引物對：

NgPiwi的正反向擴增引物：

NgPiwi-L：ATGACAGTGATTGACCTCGATTCG，

NgPiwi-RH-R：GCAAGAAAAAATATCAATTAGAGGAATCCGACAT；

RBS的正反向擴增引物：

RBS-RH-L：TGTCGGATTCCTCTAATTGATATTTTTTCTTGC，

RBS-R：TATGCACTCCTATTATTTAACTAAGTTGAC；

分別擴增得到NgPiwi基因片段和RBS片段；

b. 然后將NgPiwi基因片段和RBS片段進行融合，得到融合產物NgPiwi-RBS，

c.再將融合產物NgPiwi-RBS插入質粒PSHK5Ts的抗性基因Kan的啟動子和編碼區之間；構建得到帶有NgPiwi基因的基礎質粒pSHK5TS-NgPiwi；

2）構建帶有NgPiwi和帶有左右同源臂的待缺失的潛在毒力相關序列RR的重組質粒pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR；

a.以待缺失的潛在毒力相關序列RR對應基因的ORF缺失部分序列及ORF序列上下游各1000bp以內的序列為模板，設計引物；所述待缺失的潛在毒力相關序列RR為牛源大腸桿菌基因組上缺失潛在毒力相關序列；

b.擴增得到待缺失的潛在毒力相關序列RR的左右同源臂即為RR-LR，通過融合PCR將左右同源臂串聯成單序列，將其與基礎質粒pSHK5TS-NgPiwi進行酶切、連接，PCR鑒定篩選出正確的轉化子，提取轉化子質粒后測序鑒定，獲得帶有NgPiwi基因的重組質粒pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR；

3）牛源大腸桿菌基因敲除菌株

將pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR用CaCl₂法轉化至牛源大腸桿菌感受態中，進行PCR鑒定，篩選得到攜帶目的質粒的菌株；并傳代培養，利用NgPiwi介導的同源重組，獲得潛在毒力相關序列RR的雙交換菌株；最后將上述獲得的潛在毒力相關序列RR的雙交換菌株無抗生素條件下進行培養，誘導質粒丟失，從而獲得牛源大腸桿菌RR 基因序列敲除菌株，即為：RR 基因序列敲除的菌株ΔRR-Ecoli。

2.根據權利要求1所述基于Ngpiwi蛋白介導的牛源大腸桿菌基因敲除菌株的構建方法，其特征在于：所述步驟2）中，待缺失的潛在毒力相關序列RR選自編碼精氨酸代謝途徑中琥珀酰谷氨酸脫琥珀?；騉RF序列。