[發明專利]一種微量蛋白質樣品濃縮的方法

在審

• 申請號: 201811315445.3
• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN109438551A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 陸天聰
• 申請（專利權）人: 北京蛋白世界生物科技有限公司
• 主分類號: C07K1/113
• 分類號: C07K1/113;C07K1/34;C12P21/06
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 蘇友娟

本發明公開了一種微量蛋白質樣品濃縮的方法，在生物微量蛋白樣品中加入Laemmli加樣緩沖液和二硫蘇糖醇進行加熱變性，能夠使得生物微量蛋白樣品中的二硫鍵還原，打開了蛋白結構。然后將尿素加入樣品中，再將樣品混合物加入超濾管中，超濾濃縮，并將濃縮處理的蛋白樣品SDS?PAGE電泳、膠內酶解，即得質譜樣品，再將質譜樣品進行質譜鑒定分析。本發明能夠對超低濃度蛋白樣品進行檢測，不受樣品的體積或蛋白質濃度的限制，整個處理操作流程方便簡潔，樣品損失少、蛋白產物得率高、顯著提高質譜對微量蛋白和多肽的鑒定率。

技術領域

本發明涉及質譜樣品制備領域，尤其針對微量蛋白質樣品濃縮的方法。

背景技術

樣品制備仍是制約質譜分析的最大瓶頸問題之一，樣品制備的一致性和可重現性是決定可重復和精確的質譜分析結果成敗的關鍵所在。

當樣品的蛋白質濃度非常低時(<10微克/毫升)，例如，環境樣品，用于研究蛋白質分泌物的培養基，珍貴的生物體液樣本、大體積洗脫后的免疫共沉淀富集樣本等，其中蛋白質的含量很低，這對質譜樣品的前處理提出了很大的挑戰。通常為了能得到足夠量的蛋白，需要一種可以對樣品進行濃縮、富集并與質譜鑒定兼容的方法策略。

蛋白質濃縮技術屬于生物大分子的濃縮技術，目的是利用物理或化學的方法，除去蛋白質溶液中的水分、離子和其它小分子物質，使單位體積內的蛋白質濃度大幅度提高。蛋白質樣品經過一系列的分離提取和層析會導致樣品的稀釋，而許多分析和研究都需要高濃度或高純度的樣品，所以蛋白質樣品的濃縮至關重要。蛋白質濃縮技術主要有透析袋濃縮法、超濾膜濃縮法、冷凍干燥濃縮法、吹干濃縮法、化學沉淀法，凝膠濃縮法等。

當樣品濃度足夠大時，以上方法都可以取得滿意效果。然而當樣品濃度極低時，上述樣品濃縮處理方法存在得率低、重復性差或蛋白質選擇性損失的問題。超濾膜濃縮法、冷凍干燥濃縮法、吹干濃縮法等方法雖然理論上不存在樣品丟失問題，但對樣品中非蛋白成分要求嚴格，比如不能有不揮發鹽類和去垢劑。化學沉淀法雖然對樣品非蛋白成分沒有要求，但因蛋白質濃度過低，造成回收率低，并且自身存在選擇性回收問題。以上方法都會影響下游質譜鑒定過程。

近年來，FASP超濾輔助樣品制備獲得了普遍的認可。首先，樣品通過加入(SDS，十二烷基磺酸鈉)緩沖器進行變性和二硫鍵打開，然后利用超濾管完成尿素等緩沖液的順序交換，以完全去除SDS。蛋白質樣品經過烷基化，洗滌和消化成多肽，最終制備成無去垢劑，鹽和烷基物的純化肽。這種方法的優點在于對樣品非蛋白成分要求不高，但在處理低蛋白濃度樣品時同樣有蛋白回收率低的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供一種微量蛋白質樣品濃縮的方法，使得質譜樣品損失少、蛋白產物得率高。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種微量蛋白質樣品濃縮的方法，包括以下步驟：

a)向生物微量蛋白樣品中加入Laemmli加樣緩沖液和二硫蘇糖醇，在90～100℃下反應5min；

b)將加入步驟a)得到的混合物冷卻至室溫后加入尿素粉末，溶解后離心濃縮；

c)將步驟b)得到的濃縮物裝入超濾裝置過濾，并用尿素進行沖洗，得到超濾物；

d)將步驟c)得到的超濾物進行SDS-PAGE電泳，得到蛋白質凝膠；

e)將步驟d)得到的蛋白質凝膠進行膠內酶解，得到質譜樣品；

f)將步驟e)得到的質譜樣品進行質譜分析，并通過數據庫檢索得到生物樣品的多肽以及蛋白鑒定信息。

優選地，所述生物微量蛋白樣品與所述2×Laemmli加樣緩沖液的體積比為1：1。而對樣品本身無體積的限制。樣品濃度應低于10微克/毫升.如樣品蛋白濃度高于10微克/毫升，樣品一般不需要濃縮，可用其他方法酶解樣品。