[發(fā)明專利]一種微量蛋白質(zhì)樣品濃縮的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811315445.3
• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN109438551A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸天聰
• 申請（專利權(quán)）人: 北京蛋白世界生物科技有限公司
• 主分類號: C07K1/113
• 分類號: C07K1/113;C07K1/34;C12P21/06
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11411
• 代理人: 蘇友娟

本發(fā)明公開了一種微量蛋白質(zhì)樣品濃縮的方法，在生物微量蛋白樣品中加入Laemmli加樣緩沖液和二硫蘇糖醇進行加熱變性，能夠使得生物微量蛋白樣品中的二硫鍵還原，打開了蛋白結(jié)構(gòu)。然后將尿素加入樣品中，再將樣品混合物加入超濾管中，超濾濃縮，并將濃縮處理的蛋白樣品SDS?PAGE電泳、膠內(nèi)酶解，即得質(zhì)譜樣品，再將質(zhì)譜樣品進行質(zhì)譜鑒定分析。本發(fā)明能夠?qū)Τ蜐舛鹊鞍讟悠愤M行檢測，不受樣品的體積或蛋白質(zhì)濃度的限制，整個處理操作流程方便簡潔，樣品損失少、蛋白產(chǎn)物得率高、顯著提高質(zhì)譜對微量蛋白和多肽的鑒定率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及質(zhì)譜樣品制備領(lǐng)域，尤其針對微量蛋白質(zhì)樣品濃縮的方法。

背景技術(shù)

樣品制備仍是制約質(zhì)譜分析的最大瓶頸問題之一，樣品制備的一致性和可重現(xiàn)性是決定可重復(fù)和精確的質(zhì)譜分析結(jié)果成敗的關(guān)鍵所在。

當(dāng)樣品的蛋白質(zhì)濃度非常低時(<10微克/毫升)，例如，環(huán)境樣品，用于研究蛋白質(zhì)分泌物的培養(yǎng)基，珍貴的生物體液樣本、大體積洗脫后的免疫共沉淀富集樣本等，其中蛋白質(zhì)的含量很低，這對質(zhì)譜樣品的前處理提出了很大的挑戰(zhàn)。通常為了能得到足夠量的蛋白，需要一種可以對樣品進行濃縮、富集并與質(zhì)譜鑒定兼容的方法策略。

蛋白質(zhì)濃縮技術(shù)屬于生物大分子的濃縮技術(shù)，目的是利用物理或化學(xué)的方法，除去蛋白質(zhì)溶液中的水分、離子和其它小分子物質(zhì)，使單位體積內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度大幅度提高。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過一系列的分離提取和層析會導(dǎo)致樣品的稀釋，而許多分析和研究都需要高濃度或高純度的樣品，所以蛋白質(zhì)樣品的濃縮至關(guān)重要。蛋白質(zhì)濃縮技術(shù)主要有透析袋濃縮法、超濾膜濃縮法、冷凍干燥濃縮法、吹干濃縮法、化學(xué)沉淀法，凝膠濃縮法等。

當(dāng)樣品濃度足夠大時，以上方法都可以取得滿意效果。然而當(dāng)樣品濃度極低時，上述樣品濃縮處理方法存在得率低、重復(fù)性差或蛋白質(zhì)選擇性損失的問題。超濾膜濃縮法、冷凍干燥濃縮法、吹干濃縮法等方法雖然理論上不存在樣品丟失問題，但對樣品中非蛋白成分要求嚴格，比如不能有不揮發(fā)鹽類和去垢劑。化學(xué)沉淀法雖然對樣品非蛋白成分沒有要求，但因蛋白質(zhì)濃度過低，造成回收率低，并且自身存在選擇性回收問題。以上方法都會影響下游質(zhì)譜鑒定過程。

近年來，F(xiàn)ASP超濾輔助樣品制備獲得了普遍的認可。首先，樣品通過加入(SDS，十二烷基磺酸鈉)緩沖器進行變性和二硫鍵打開，然后利用超濾管完成尿素等緩沖液的順序交換，以完全去除SDS。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過烷基化，洗滌和消化成多肽，最終制備成無去垢劑，鹽和烷基物的純化肽。這種方法的優(yōu)點在于對樣品非蛋白成分要求不高，但在處理低蛋白濃度樣品時同樣有蛋白回收率低的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種微量蛋白質(zhì)樣品濃縮的方法，使得質(zhì)譜樣品損失少、蛋白產(chǎn)物得率高。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種微量蛋白質(zhì)樣品濃縮的方法，包括以下步驟：

a)向生物微量蛋白樣品中加入Laemmli加樣緩沖液和二硫蘇糖醇，在90～100℃下反應(yīng)5min；

b)將加入步驟a)得到的混合物冷卻至室溫后加入尿素粉末，溶解后離心濃縮；

c)將步驟b)得到的濃縮物裝入超濾裝置過濾，并用尿素進行沖洗，得到超濾物；

d)將步驟c)得到的超濾物進行SDS-PAGE電泳，得到蛋白質(zhì)凝膠；

e)將步驟d)得到的蛋白質(zhì)凝膠進行膠內(nèi)酶解，得到質(zhì)譜樣品；

f)將步驟e)得到的質(zhì)譜樣品進行質(zhì)譜分析，并通過數(shù)據(jù)庫檢索得到生物樣品的多肽以及蛋白鑒定信息。

優(yōu)選地，所述生物微量蛋白樣品與所述2×Laemmli加樣緩沖液的體積比為1：1。而對樣品本身無體積的限制。樣品濃度應(yīng)低于10微克/毫升.如樣品蛋白濃度高于10微克/毫升，樣品一般不需要濃縮，可用其他方法酶解樣品。