[發明專利]一種觀察微小組織內細胞立體分布及統計細胞數目的方法

有效

• 申請號: 201811311740.1
• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN109406768B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 朱家橋;劉宗平;卞建春;劉學忠;袁燕;顧建紅;張江虹
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64;G01N1/30
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 董旭東

1.一種觀察微小組織內細胞立體分布的方法，其特征在于，包括以下步驟：獲取待觀察的組織材料并進行表面清洗；對所獲取的組織材料進行化學固定和脫水處理；對脫水處理后的組織材料進行免疫熒光染色；對免疫熒光染色的組織材料進行透明化處理；將透明化處理的組織材料連同透明液移至共聚焦顯微鏡專用培養皿，用激光共聚焦顯微鏡進行逐層掃描拍照，獲得整體組織各層的細胞分布圖像，進行細胞立體分布的觀察；

組織材料的化學固定步驟包括：在2～5℃的條件下將沖洗后的組織材料浸泡在質量濃度為3.5～4.5％多聚甲醛水溶液中固定2～2.5小時；之后，移除多聚甲醛水溶液，在2～5℃的條件下，將組織材料分別用磷酸緩沖液進行振蕩洗脫3～4小時，所述磷酸緩沖液每隔1小時更換一次；

所述脫水處理步驟包括：移除脫水處理后的組織材料中磷酸緩沖液，在2～5℃的條件下，將組織材料用質量濃度為9～11％和19～21％的蔗糖水溶液分別振蕩洗脫3～4小時；之后，繼續在2～5℃的條件下將組織材料用質量濃度為29～31％的蔗糖水溶液振蕩洗脫12-15小時；

所述免疫熒光染色步驟包括：移除脫水處理后的蔗糖溶液，將組織材料依次進行透膜處理和封閉處理、然后分別用一抗和熒光標記的二抗依次孵育48～72小時，最后通過熒光染料進行熒光染色；

所述一抗和二抗孵育過程包括：

S1)移除封閉處理的封閉液，在4～5℃條件下，將封閉處理的組織材料移入一抗溶液中，以50～60rpm的轉速搖床孵育48～72小時；

S2)移除一抗溶液，在2～5℃條件下，用質量濃度為0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液進行清洗，以50～60rpm的轉速搖床洗滌3～4小時，且每隔1小時更換一次水溶液；

S3)移除上步的清洗水溶液，將組織材料移入二抗溶液中，在2～5℃避光條件下，以50～60rpm的轉速搖床孵育48～72小時，如果S1)中的一抗耦合有熒光基團，本步省略；

S4)移除二抗溶液，在2～5℃條件下，將組織材料移入質量濃度0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液進行清洗，以50～60rpm的轉速搖床洗滌3～4小時，且每隔1小時更換一次水溶液，如果S3)省略，則本步省略；

S5)移除上步的清洗液，在2～5℃避光條件下，將組織材料移入DAPI稀釋液中，以50～60rpm的轉速搖床孵育10～12小時，以識別標記組織內所有細胞，所述DAPI稀釋液為4′，6-二脒基-2-苯基吲哚稀釋水溶液；

所述透明化處理步驟包括：將免疫熒光染色的組織材料移入透明液中，在20～25℃避光條件下，以50～60rpm的轉速搖床孵育48～72小時，所述透明液為以下質量組份的水溶液：22～26％的尿素、8～12％的甘油、0.09～0.12％的聚乙二醇辛基苯基醚、48～52％的蔗糖；

一種基于所述觀察微小組織內細胞立體分布的方法來統計微小組織內細胞數目的方法，具體包括：獲得微小組織各層的細胞分布圖像，通過Imaris軟件處理各層細胞分布圖像數據，重建組織的三維模型，觀察三維立體模型中被免疫熒光標記細胞的立體分布，再利用ImarisBitplaneSpot檢測分析，計算出免疫熒光標記細胞的準確數目。

2.根據權利要求1所述的觀察微小組織內細胞立體分布的方法，其特征在于，所述組織材料的厚度小于500μm.所述逐層掃描拍照的層厚間距為1～5μm。

3.根據權利要求1所述的觀察微小組織內細胞立體分布的方法，其特征在于，所述透膜處理過程為：在20～25℃的條件下，將組織材料在透膜液中振蕩孵育12～15小時，所述透膜液為質量濃度為0.4～0.6％的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。

4.根據權利要求1所述的觀察微小組織內細胞立體分布的方法，其特征在于，所述封閉處理過程為：移除透膜處理的組織材料中的透膜液，在4～5℃的條件下，將透膜處理的組織材料在封閉液中振蕩孵育12～15小時，所述封閉液成分包括以下質量組份水溶液：0.4～0.6％的聚乙二醇辛基苯基醚、0.10～0.20％的甘氨酸、9～11％的胎牛血清、3～4％的牛血清白蛋白。