[發(fā)明專利]一種觀察微小組織內(nèi)細(xì)胞立體分布及統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)目的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811311740.1
• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN109406768B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱家橋;劉宗平;卞建春;劉學(xué)忠;袁燕;顧建紅;張江虹
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64;G01N1/30
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責(zé)任公司 32102
• 代理人: 董旭東

本發(fā)明涉及生物組織的微觀觀察技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)一種觀察微小組織內(nèi)細(xì)胞立體分布及統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)目的方法，將獲取的待觀察組織材料進行表面清洗后依次進行化學(xué)固定、脫水處理、免疫熒光染色和透明化處理；再將組織材料連同透明液移至共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿，用激光共聚焦顯微鏡進行逐層掃描拍照，獲得整體組織各層的細(xì)胞分布圖像，進行細(xì)胞立體分布的觀察，再通過Imaris軟件處理各層細(xì)胞分布圖像數(shù)據(jù)，重建細(xì)胞組織的三維模型，觀察三維立體模型中被免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞的立體分布，再利用Imaris Bitplane Spot檢測分析，計算出免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞的準(zhǔn)確數(shù)目。本發(fā)明的方法保持了待觀察組織的完整性，而且觀察細(xì)胞分布的清晰度和準(zhǔn)確度都高，細(xì)胞的數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果更準(zhǔn)確。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物組織的微觀觀察技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種觀察微小組織內(nèi)細(xì)胞立體分布及統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)目的方法。

背景技術(shù)

在生命科學(xué)研究和臨床病理學(xué)分析中，觀察生物組織中細(xì)胞的微觀分布和統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)目，對研究細(xì)胞分化、組織發(fā)育、疾病發(fā)生等具有非常重要的意義。研究這一過程的常規(guī)方法是對組織進行連續(xù)切片后，利用免疫組織化學(xué)染色，然后通過不同切片間的圖像數(shù)據(jù)拼接和疊加來模擬和推測出完整組織中細(xì)胞的分布，進而推算特定細(xì)胞的數(shù)目。但是，這一常規(guī)方法的局限性是，連續(xù)切片并不能完全顯示真正的組織全貌、細(xì)胞分布和特定細(xì)胞數(shù)量。組織切片只能顯示某一個層面的細(xì)胞分布和數(shù)量，況且在實際制作切片時，很難避免對組織的破壞和丟失，無法保證單個切片細(xì)胞分布和數(shù)量的準(zhǔn)確性，同時，也很難保證不同切片厚度的均一性，這就導(dǎo)致疊加后的結(jié)果更加不準(zhǔn)確，即便是用數(shù)學(xué)模型來重建和計算，其最終的結(jié)果也只是預(yù)測和估算而已，并非真實的圖像和數(shù)據(jù)，這就造成同樣的生物組織樣品，最后結(jié)果的可變系數(shù)非常大，特別是細(xì)胞數(shù)量的結(jié)果可信度不高。

如何在保持組織完整性的同時，觀察特定細(xì)胞在組織內(nèi)部的分布和數(shù)量，是生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究的一個重點和熱點。雖然，現(xiàn)在臨床醫(yī)學(xué)常用的計算機斷層掃描（CT），正電子發(fā)射計算機斷層掃描（PETCT）, 核磁共振成像（MRI）等技術(shù)得到了快速發(fā)展，但到目前為止，其分辨率仍達(dá)不到細(xì)胞水平或亞細(xì)胞水平。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是，提供一種保持組織完整性的同時觀察微小組織內(nèi)細(xì)胞立體分布及統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)目的方法，為生命科學(xué)研究和臨床病理學(xué)分析提供一種在細(xì)胞水平或亞細(xì)胞水平觀察組織和統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)量的方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明首先提供一種觀察微小組織內(nèi)細(xì)胞立體分布的方法，包括以下步驟：獲取待觀察的組織材料并進行表面清洗；對所獲取的組織材料進行化學(xué)固定和脫水處理；對脫水處理后的組織材料進行免疫熒光染色；對免疫熒光染色的組織材料進行透明化處理；將透明化處理的組織材料連同透明液移至共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿，用激光共聚焦顯微鏡進行逐層掃描拍照，獲得整體組織各層的細(xì)胞分布圖像，進行細(xì)胞立體分布的觀察。

本發(fā)明的方法，通過對整體生物組織進行化學(xué)固定、脫水處理、免疫熒光染色和透明化處理，保持獲取的整體生物組織的完整性，對組織內(nèi)的特異性細(xì)胞進行識別和熒光標(biāo)記以便于觀察，然后通過激光共聚焦顯微鏡進行逐層掃描拍照，獲得整體組織各層的細(xì)胞分布圖像，進行細(xì)胞立體分布的觀察。本發(fā)明的方法中對生物組織的整體處理和觀察過程，保持組織整體的完整性，不需要分層切片觀察，實現(xiàn)細(xì)胞水平或亞細(xì)胞水平的高分辨率精確觀察。

作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述組織材料的厚度小于500μm，所述逐層掃描拍照的層厚間距為1～5μm。

本發(fā)明的組織材料的化學(xué)固定步驟包括：組織材料的化學(xué)固定步驟包括：在2～5℃的條件下將沖洗后的組織材料浸泡在質(zhì)量濃度為3.5～4.5%多聚甲醛水溶液中固定2～2.5小時；之后，移除多聚甲醛水溶液，在2～5℃的條件下，將組織材料分別用磷酸緩沖液進行振蕩洗脫3～4小時，所述磷酸緩沖液每隔1小時更換一次。通過本步的處理，降低組織中蛋白質(zhì)、肽類物質(zhì)等多種物質(zhì)的水溶性以便于將組織材料進行硬化固定，保證整體組織的完整性。