[發(fā)明專利]一種高效制備長效干擾素的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811311243.1
• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN111139263B
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭麗舒;侯云德
• 申請（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C07K19/00;C07K1/22;C07K1/16
• 代理公司: 北京元中知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11223
• 代理人: 王明霞

本發(fā)明屬于治療性生物制劑領(lǐng)域，公開了一種高效制備長效干擾素的方法，所述的方法包括：(1)構(gòu)建表達(dá)長效干擾素的重組載體；(2)將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)過多次篩選獲得高表達(dá)克隆池；(3)從獲得的高表達(dá)克隆池中篩選高表達(dá)單克隆CHO細(xì)胞株；(4)高表達(dá)單克隆CHO細(xì)胞株發(fā)酵培養(yǎng)，并進(jìn)行目標(biāo)蛋白的純化和檢測。本發(fā)明通過多輪篩選高表達(dá)克隆池、進(jìn)一步篩選高表達(dá)單克隆細(xì)胞株的方式，結(jié)合改進(jìn)的純化方法，大大提高了半衰期延長的長效干擾素的產(chǎn)量，且步驟簡單，有利于長效干擾素的擴(kuò)大生產(chǎn)及應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于治療性生物制劑領(lǐng)域，具體地說，涉及一種高效制備長效干擾素的方法。

背景技術(shù)

干擾素(Interferon)是人和動物的細(xì)胞在受細(xì)菌、病毒感染或核苷酸等刺激物的誘導(dǎo)下分泌的一組具有抗病毒等活性的多功能糖蛋白；是最早用于疾病臨床治療的細(xì)胞因子。干擾素主要有α干擾素、β干擾素、γ干擾素和ω干擾素等類型，根據(jù)干擾素產(chǎn)生的細(xì)胞來源、受體、氨基酸結(jié)構(gòu)及對酸耐受程度的不同，可將干擾素分為I型干擾素和II型干擾素，其中I型干擾素包括α干擾素、β干擾素和ω干擾素；I型干擾素被稱為抗病毒干擾素，其生物學(xué)效應(yīng)主要以抗病毒為主，同時具有抑制細(xì)胞生長，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等生物活性。γ干擾素屬于II型干擾素，抗病毒活性較I型干擾素弱，其生物學(xué)活性主要表現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)和參與組織相容性抗原的表達(dá)，又稱為免疫干擾素。

作為細(xì)胞因子，干擾素分子的半衰期較短，為保持有效的治療血藥濃度，需頻繁給藥，為了適應(yīng)臨床的需要，延長其半衰期成為了干擾素研究的一個熱點(diǎn)。已經(jīng)有很多方法嘗試用于延長治療性蛋白質(zhì)的半衰期，其中包括改變氨基酸序列，但該方法在減少血清和肝臟的酶對蛋白質(zhì)降解的同時也降低了蛋白的抗原作用；也可將藥物蛋白與免疫球蛋白或者白蛋白融合延長半衰期。另外，還可以將多肽分子包裝到不可溶的固體基質(zhì)中并且固定到聚合體上。

CTP(carboxyl-terminal peptide)技術(shù)是由華盛頓大學(xué)Irving Boime教授發(fā)現(xiàn)的一種新型長效技術(shù)。CTP是人絨毛膜促性腺激素亞基(hCGβ)的羧基末端肽(C-terminalpeptide，CTP)，含有四個O-糖基化位點(diǎn)，與細(xì)胞因子或其他蛋白質(zhì)融合后，能夠顯著延長與其融合的蛋白分子的半衰期，并且對蛋白分子的活性影響小甚至可以增強(qiáng)其活性。然而，在制備半衰期長的長效干擾素時，真核系統(tǒng)表達(dá)的長效干擾素一般培養(yǎng)基中有血清，且產(chǎn)量較低，不能滿足大量生產(chǎn)的需求。

有鑒于此特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高效制備長效干擾素的方法。本發(fā)明通過多輪篩選高表達(dá)克隆池、進(jìn)一步篩選高表達(dá)單克隆細(xì)胞株的方式，結(jié)合改進(jìn)的純化方法，大大提高了半衰期延長的長效干擾素的產(chǎn)量，且步驟簡單，有利于長效干擾素的擴(kuò)大生產(chǎn)及應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用技術(shù)方案的基本構(gòu)思是：

本發(fā)明的第一目的是提供一種高效制備長效干擾素的方法，所述的方法包括：

(1)構(gòu)建表達(dá)長效干擾素的重組載體；

(2)將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)過多次篩選獲得高表達(dá)克隆池，然后懸浮培養(yǎng)；

(3)從獲得的高表達(dá)克隆池中篩選高表達(dá)單克隆CHO細(xì)胞株；

(4)高表達(dá)單克隆CHO細(xì)胞株發(fā)酵培養(yǎng)，并進(jìn)行目標(biāo)蛋白的純化和檢測。