[發明專利]一種高效制備長效干擾素的方法

有效

• 申請號: 201811311243.1
• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN111139263B
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發明（設計）人: 鄭麗舒;侯云德
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C07K19/00;C07K1/22;C07K1/16
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 王明霞

1.一種高效制備長效干擾素的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)構建表達長效干擾素的重組載體；

(2)將構建的重組載體轉染CHO細胞，經過多次篩選獲得高表達克隆池，懸浮培養；

(3)從獲得的高表達克隆池中篩選高表達單克隆CHO細胞株；

(4)高表達單克隆CHO細胞株發酵培養，并進行目標蛋白的純化和檢測。

2.根據權利要求1所述的一種高效制備長效干擾素的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，重組載體轉染CHO細胞后，至少經過三次斑點印記雜交篩選獲得高表達克隆池；

優選的，篩選步驟包括：重組載體轉染CHO細胞后恢復48h后鋪板，加入篩選培養基，接種到孔板，50uM MTX加壓后進行斑點印記雜交篩選，然后再進行五次篩選，每次篩選時均選取濃度高的孔轉入新孔板，并分別采用100uM、200uM、400uM、800uM、1200MTX加壓后進行斑點印記雜交篩選和/或PCD比較，獲得高表達克隆池。

3.根據權利要求1或2所述的一種高效制備長效干擾素的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中，從獲得的高表達克隆池中篩選高表達單克隆CHO細胞株的方法包括：采用有限稀釋法將細胞接種在96孔板中，選擇單細胞的孔，進行懸浮培養并檢測其干擾素表達量，然后重復上述步驟并再進行至少四輪篩選，獲得高表達單克隆CHO細胞株；

優選的，每次懸浮培養后，通過檢測干擾素表達量，結合細胞翻倍時間和細胞結團情況篩選單克隆。

4.根據權利要求1-3任一所述的一種高效制備長效干擾素的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，所述的懸浮培養為補料分批培養，包括：

取對數生長期細胞，離心，采用基礎培養基稀釋細胞后轉入搖瓶，37℃，5％CO₂，120rpm搖床培養；第3天開始加入20％補料培養基，第4天開始補糖，第5天培養溫度降為33℃，培養11天后離心收集上清；

優選的，所述的基礎培養基包括添加了6mmol/L谷氨酰胺的CD01細胞培養基；

優選的，所述的補料培養基包括PFF06培養基。

5.根據權利要求1-4任一所述的一種高效制備長效干擾素的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中，所述的重組載體包括干擾素α-2b的核苷酸序列，所述的干擾素α-2b的核苷酸序列的至少N端連接有羧基末端肽，所述的羧基末端肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.根據權利要求1-5任一所述的一種高效制備長效干擾素的方法，其特征在于，所述的干擾素α-2b的核苷酸序列的N端的羧基末端肽的上游還連接有信號肽，所述的信號肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.根據權利要求1-6任一所述的一種高效制備長效干擾素的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，干擾素進行純化包括以下步驟：

(1)藍膠染料親和層析；

(2)分子篩純化；

(3)蛋白樣品含量測定。

8.根據權利要求7所述的一種高效制備長效干擾素的方法，其特征在于，所述的藍膠染料親和層析采用低鹽上樣高鹽洗脫的方式；

優選的，藍膠染料親和層析中采用的結合液包括50mM Na₂HPO₄，50mM檸檬酸鈉，pH為7.0；

優選的，藍膠染料親和層析中采用的洗脫液包括50mM Na₂HPO₄，50mM檸檬酸鈉，1-2MNaCl，pH為7.0。

9.根據權利要求7或8所述的一種高效制備長效干擾素的方法，其特征在于，分子篩純化過程包括：

(1)超純水洗柱；(2)利用含有0.5M NaCl的PBS溶液平衡柱；(3)上樣；(4)采用含有0.5MNaCl的PBS溶液洗脫，收集洗脫后的蛋白樣品。

優選的，所述的分子篩為GE Healthcare Superdex 200，藍膠染料親和層析后獲得的蛋白經過超濾離心濃縮后進行分子篩純化。

10.根據權利要求7-9任一所述的一種高效制備長效干擾素的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，將高表達單克隆CHO細胞株的發酵液在4℃條件下10000rpm離心30分鐘，上清過濾，然后進行純化。