[發(fā)明專利]CrGlut1表達(dá)基因、表達(dá)載體、萊茵衣藻工程藻及制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811310625.2
• 申請(qǐng)日: 2018-11-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109439666A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡章立;黃觀欽;賈彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/79;C12N1/13;C12N15/66
• 代理公司: 深圳市恒申知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 44312
• 代理人: 袁文英

本發(fā)明公開(kāi)了一種CrGlut1表達(dá)基因，具有序列表SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列。本發(fā)明以上通過(guò)對(duì)萊茵衣藻和人源密碼子使用情況以及Glut1基因的密碼子偏好性進(jìn)行分析，并根據(jù)萊茵衣藻表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏好性對(duì)Glut1基因進(jìn)行優(yōu)化改造后獲得的CrGlut1表達(dá)基因，具有高效表達(dá)人源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能力，并且表達(dá)生產(chǎn)的Glut1蛋白具有生物活性；同時(shí)轉(zhuǎn)化對(duì)象藻細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)運(yùn)胞外葡萄糖，于黑暗條件下能利用葡萄糖生長(zhǎng)，具有顯著的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種CrGlut1表達(dá)基因、表達(dá)載體、萊茵衣藻工程藻及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

微藻作為生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)物和能量的最初級(jí)提供者，具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、占地面積小，能合成許多結(jié)構(gòu)和生理功能獨(dú)特的生物活性物質(zhì)，和環(huán)境效益顯著等優(yōu)點(diǎn)蘊(yùn)含著巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)潛力。在這種背景下，微藻生物技術(shù)的研究受到各國(guó)政府高度重視，并且對(duì)微藻資源的開(kāi)發(fā)利用提出了新的需求，給微藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了新機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

利用工業(yè)發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行對(duì)微藻進(jìn)行異養(yǎng)化高細(xì)胞密度培養(yǎng)是目前微藻工業(yè)化生產(chǎn)的一種發(fā)展趨勢(shì)，異養(yǎng)化培養(yǎng)發(fā)酵具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)可控制培養(yǎng)條件使微藻生長(zhǎng)維持在最佳狀態(tài)；2)以有機(jī)碳源作為培養(yǎng)基成分，大幅度降低了培養(yǎng)成本，提高了生長(zhǎng)速度，實(shí)現(xiàn)了藻細(xì)胞高密度培養(yǎng)；3)采用密閉發(fā)酵罐，能夠?qū)崿F(xiàn)無(wú)菌培養(yǎng)、單位體積產(chǎn)率高、產(chǎn)品質(zhì)量可控穩(wěn)定且藻細(xì)胞收集方便等優(yōu)勢(shì)。

一些藻類能利用有機(jī)物作為唯一碳源和能源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，異養(yǎng)化培養(yǎng)微藻，即通過(guò)在發(fā)酵罐黑暗需氧發(fā)酵生長(zhǎng)條件下添加葡萄糖等有機(jī)碳源對(duì)微藻進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到快速生長(zhǎng)且高生物量的目的。近年來(lái)對(duì)于微藻異養(yǎng)培養(yǎng)的研究已經(jīng)受到了眾多的重視，在對(duì)微藻異養(yǎng)方面的研究主要針對(duì)于工藝上的優(yōu)化以達(dá)到更快的生長(zhǎng)速度和更高的生物量，其中我國(guó)研究人員錢峰慧對(duì)蛋白核小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)基和補(bǔ)料策略進(jìn)行了優(yōu)化，在50L發(fā)酵罐中通過(guò)間歇補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式培養(yǎng)100h后，藻細(xì)胞密度最高可150g/L。

微藻作為一種光合生物，并非所有的微藻都能進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，絕大部分生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物的微藻在光合生長(zhǎng)時(shí)的生物量并不能滿足大規(guī)模工業(yè)的需求，因此人們期待通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)微藻進(jìn)行改造，從而達(dá)到使的微藻能夠大規(guī)模利用有機(jī)碳源進(jìn)行高密度異養(yǎng)生長(zhǎng)。

目前關(guān)于微藻的異養(yǎng)生長(zhǎng)機(jī)理的研究還不夠深入，其中作為能量來(lái)源的糖類物質(zhì)必須穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)部，才能被微藻利用，有理論認(rèn)為由于某些微藻缺乏轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)物的運(yùn)輸機(jī)制，導(dǎo)致微藻只能進(jìn)行光合自養(yǎng)。Zasjavskaia等通過(guò)對(duì)三角褐指藻(UTCC646)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)基因的轉(zhuǎn)入，使其帶有運(yùn)輸葡萄糖的能力，所用的轉(zhuǎn)運(yùn)基因包括來(lái)自人類紅細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(Glut1)，來(lái)自小球藻的Hup1，以及來(lái)自釀酒酵母的Hxt1、Hxt2和Hxt4，置于黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入Glut1基因的三角褐指藻(UTCC646)能夠以葡萄糖為唯一碳源并且能夠在黑暗條件下生長(zhǎng)。

隨著基因工程技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，通過(guò)對(duì)有改造潛力的藻類進(jìn)行定向基因工程改造是一種行之有效的方法。微藻作為生物反應(yīng)器具有廣闊的發(fā)展前景和巨大潛力，能夠表達(dá)具有高活性的蛋白，利用其作為轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器通過(guò)在可控條件下利用發(fā)酵方式生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物。因此，以此為基礎(chǔ)，構(gòu)建能夠表達(dá)出具實(shí)質(zhì)特異性活性蛋白的基因工程藻，非常符合產(chǎn)業(yè)和效益的發(fā)展需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種能夠以萊茵衣藻為宿主進(jìn)行大量表達(dá)生產(chǎn)Glut1蛋白的CrGlut1表達(dá)基因，旨在利用萊茵衣藻作為轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器通過(guò)在可控條件下利用發(fā)酵方式生產(chǎn)具有生物活性的Glut1蛋白產(chǎn)物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的CrGlut1表達(dá)基因，具有序列表SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列。