[發明專利]單鏈測序文庫的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201811306568.0
• 申請日: 2018-11-05
• 公開（公告）號: CN109536579B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 張巨永;盧瀚林
• 申請（專利權）人: 深圳市艾斯基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 廣州高炬知識產權代理有限公司 44376
• 代理人: 董博

本發明公開了提供了高通量測序文庫的構建方法及其應用。其中，構建高通量測序文庫的方法包括：將基因組DNA片段化和末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A，連接接頭并擴增后，將所述DNA文庫用外切酶進行消化得到單鏈DNA文庫；利用特異性探針對連接產物進行雜交捕獲，以便獲得目的片段。本發明改進DNA雜交流程，將常規雙鏈DNA模板通過酶切消化成單鏈，再采用環狀寡核苷酸的完全封閉引入的接頭和標簽序列，用探針(RNA或DNA)對單鏈DNA模板進行捕獲，可以降低雜交捕獲的時間，提高探針捕獲目的DNA序列的效率，降低GC區域捕獲的偏好性。

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體地，涉及涉及確定樣本的目標DNA片段的靶向測序技術。更具體地，本發明提供了一種構建高通量測序文庫的方法、一種確定樣本的目標DNA片段的測序方法、一種用于確定樣本目標DNA片段的裝置以及一種用于構建樣本目標DNA片段高通量測序文庫的試劑盒。

背景技術

近年來崛起的新一代高通量測序技術能夠同時對數十億個DNA片段進行測序，為基礎生物醫學研究和臨床檢測提供了一個強大的工具。全基因組測序以其全面綜合的檢測性能廣泛應用于基礎科研領域，然而全基因組測序的成本和分析的復雜程度還是讓科研人員倍感困難，盡管新一代測序(NGS)的通量越來越高，而費用越來越低，但它仍不是大多數遺傳實驗室和臨床檢測中心可行的選擇。對于復雜疾病的研究更是如此，這類研究至少需要數百個樣本，以實現足夠的統計能力，這么多樣本的全基因組測序，無論從成本考慮，還是從數據分析考慮，都是相對困難的。

因此另一測序技術就應運而生—目標靶向測序技術，目標靶向測序技術是通過一些不同的方法對我們感興趣的目標DNA進行捕獲制備成測序文庫，再通過高通量測序進行測序分析，得到目標DNA的序列，例如外顯子捕獲測序，其捕獲和測定大約30MB的全基因組外顯子序列，其測序成本只有全基因組測序的百分之一。目標靶向測序技術杜宇龐大的人類或高等生物的基因組，可以成百上千倍地提高測序效率，及大地提高樣本的通量，是高通量測序技術更好地應用于臨床檢測領域，目前發展了多種目標靶向測序技術，其主要分為一種是基于探針的捕獲的富集技術，另一種是基于多重PCR的富集技術。

基于多重PCR的目標靶向測序技術以其簡便的實驗流程應用于一些臨床檢測領域，但其大多只能捕獲小于1MB的區域，大都只能檢測已知突變，且檢測的穩定性差，這些特性都限制了其在臨床的應用。基于探針的目標靶向測序技術能夠捕獲大于10mb以上的區域，且穩定性好，可以檢測多種類型的突變，并且可以定制不同的檢測區域，在臨床應用具有極大的潛力。

然而，基于探針捕獲的目標靶向測序技術其建庫流程長，探針為了能夠充分地和目標區域結合需要雜交1-2天甚至更長的時間，大大限制了臨床檢測的時效性。另外雜交捕獲的效率有限(通常只有50-60％的捕獲效率)，其浪費在非目標區域的數據也無形中增加了探針捕獲的成本。

發明內容

本發明旨在解決現有技術問題的至少之一。本發明的第一方面提供了如下的技術方案：

將基因組DNA片段化，以便獲得DNA片段；

將所述DNA片段進行末端修復，以便獲得經過末端修復的DNA片段；

在所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A，以便獲得具有粘性末端A的DNA片段；

將所述具有粘性末端A的DNA片段與接頭相連，以便獲得連接產物；

將所述連接產物通過一條帶有5端磷酸化的引物和另一條5端不帶有磷酸化的引物進行PCR擴增，得到DNA文庫；

將所述DNA產物用外切酶進行消化得到單鏈DNA文庫；

在本發明一個優選的實施例中，所述外切酶為lambda核酸外切酶；