[發明專利]單鏈測序文庫的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201811306568.0
• 申請日: 2018-11-05
• 公開（公告）號: CN109536579B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 張巨永;盧瀚林
• 申請（專利權）人: 深圳市艾斯基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 廣州高炬知識產權代理有限公司 44376
• 代理人: 董博

1.一種構建高通量測序文庫的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將基因組DNA片段化，以便獲得DNA片段；

將所述DNA片段進行末端修復，以便獲得經過末端修復的DNA片段；

在所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A，以便獲得具有粘性末端A的DNA片段；

將所述具有粘性末端A的DNA片段與接頭相連，以便獲得連接產物；

將所述連接產物通過一條帶有5端磷酸化的引物和另一條5端不帶有磷酸化的引物進行PCR擴增，得到DNA文庫；

將所述DNA產物用外切酶進行消化得到單鏈DNA文庫；

將所述DNA文庫與封閉寡核苷酸，特異性探針混合以進行雜交捕獲，所述封閉寡核苷酸會形成環狀封閉DNA文庫兩端引入的接頭和/或標簽序列，所述特異性探針對所述連接產物進行雜交捕獲，以便獲得目的片段；其中，所述環狀封閉寡核苷酸是對接頭和/或標簽序列設計的，所述封閉寡核苷酸兩段分別與DNA文庫兩端的接頭和/或標簽序列互補配對，連接形成閉環，實現環狀封閉；

任選地，所述外切酶為lambda核酸外切酶；

任選地，所述雜交捕獲為6~8h;

任選地，所述雜交捕獲后用帶有鏈霉親和素的磁珠吸附并洗滌；

將獲得的所述目的片段進行PCR擴增，以便獲得擴增產物；

任選地，所述PCR擴增擴增10-12個循環；

以及分離純化所述擴增產物，所述擴增產物構成所述高通量測序文庫，

任選地，進一步包括從樣本中提取基因組DNA的步驟，

任選地，利用covaris-S2打斷儀將基因組DNA片段化，

任選地，所述DNA片段的長度為約150-300bp，

任選地，在將所述DNA片段進行末端修復前，進一步包括純化DNA片段的步驟，

任選地，將所述DNA片段進行末端修復是利用Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶進行的，其中，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’聚合酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性，

任選地，將所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A是利用Klenow (3’-5’exo-)進行的，

任選地，所述接頭中包含標簽序列，

任選地，將所述具有粘性末端A的DNA片段與接頭相連是利用T4 DNA連接酶進行的，

任選地，在獲得連接產物后，進一步包括對連接產物進行純化的步驟，

任選地，所述特異性探針是采用eArray系統設計的，

任選地，所述探針的長度為120mer，

任選地，采用1μg的連接產物進行所述雜交捕獲，

任選地，使用熱啟動 DNA聚合酶進行所述PCR擴增，

任選地，分離純化所述擴增產物是通過選自磁珠純化、純化柱純化和2%的瓊脂糖凝膠電泳的至少一種進行的，

任選地，所述高通量測序文庫的文庫片段長度為300~450bp。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣本來源于哺乳動物、植物、和微生物的至少一種。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物為人和小鼠的至少一種。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因組DNA為人類全血基因組DNA。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因組DNA為外周血單核細胞基因組DNA。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因組DNA的量為2μg。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA片段的長度為200-250bp。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過2%的瓊脂糖凝膠電泳進行。